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[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Je souhaite réaliser des tests d'expressions de protéines recombinantes (système bactérien) en format plaque 96 puits (différents vecteurs, TAG, condition de culture, souche bactérienne etc). Je suis à la recherche d'un système permettant, après la lyse du culot bactérien, de séparer rapidement les fractions solubles et insolubles des protéines, directement en système 96 puits.  [...] Existe t-il un système permettant de séparer les fractions solubles/insolubles directement en plaque 96 puits. Est ce qu'il y a des utilisateurs qui ont l'habitude de faire de la production de protéines recombinantes en plaques.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème culture cellulaire HEK293 en plaque 96 puits

Je travaille actuellement avec des HEK293 que j'ai repiquées en plaque 96 puits dans le but de faire un MTS. 24h après le repiquage (~10000 cellules/puits), mes cellules apparaissent adhérentes, belles et bien éparpillées dans le puits mais peu confluentes (20% grand max).  [...] La seule solution potable que j'ai trouvé c'est d'incliner ma plaque 96p à l'opposé de moi (donc vers le fond de ma hotte) et de poser les tips inclinés le long de la paroi des puits (le haut de la pipette étant orienté vers le fond de la hotte). Et surtout de déposer ma solution très très très très doucement.  [...]

lyse des cardiomyocytes par tampon de lyse et dilution du lysat cellulaire en protéine

J'ai lysé mes cardiomyocytes par le tampon de Karla j'ai mis 1ml par puits d'un plaque de 6 puits mais proteinés sont diluées dans le tampon de lyse je ne sais pas comment les concentré.  [...] Avez-vous testé l'absence de peptides Il se peut aussi que la lyse ne soit pas effectuée correctement/complètement, ce qui limiterait fortement la diffusion des constituants du cytosol.   [...]

[Biotechnologie] Pb profiles electrophoretiques de proteines decales

Je travaille actuellement sur un appareil utilisant un systeme de plaque avec puits (10 puits pour echantillon et un puit pour le ladder) pour realiser des migrations de proteines (hordeine).  [...] la tension a la meme valeur entre les 2 labos.. Ce sont des petites electrodes qui viennent tremper dans chaque puit et qui apportent une certaine tension pour la migration des proteines dans les canaux de la plaque.  [...]

[Biologie Cellulaire] lame de malassez

Si tu as 30000 cellules par puits et que chaque puits fait 1 ml, pour une plaque de 6 puits, tu auras bien 30000*6= 180000 cellules au total pour ta culture.  [...] En fait au départ j'ai une plaque de culture à 6puits et 2mL de milieu de culture par puit avec 30000 cellules par puit ca c'est mon énoncé je suis d'accord avec toi ca fait vraiment pas beaucoup de cellules c'est ca qui m'embrouille un peu l'esprit et de la mon prof trouve d'après malassez qu'il y a 4*10exp6 cellules dans 6mL je ne vois pas dutout d'où ca vient.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage immuno fluorescent

Bonjour tout le monde, mon problème est le suivant. je souhaiterais cultiver mes cellules sur lames de verre en plaque 24 puits mais je n'arrive pas a trouver des lames de verres rondes de diamètre inférieur à 1.5 cm. En j'ai cherché pourtant. Si vous cultivé sur lames de verre pour faire vos marquages en immunofluorescence pourriez vous m'indiquer le fournisseur des lames de culture Merci par avance.  [...] Attention. toutes les cellules n'adhèrent pas sur du verre et il faut souvent faire un coating.   [...]

[Biologie Cellulaire] 96 puits et microscope inversé

je fais de la culture de cellule HEK et je souhaite faire de la fluorescence (GFP, Cy3) avec un microscope inversé. Quel fond dois-je utilisé pour mes plaque 96 puits Une référence particulière à me donner.  [...] Ben pour de la culture c'est à fond plat type costar 3599. Reste le souci de la microscopie en fluo derrière. Il faudrait voir si il n'y a pas des labtek adaptées à votre problème mais j'en doute. Il vous faut absolument les 96 puits ou c'est la taille du puit qui vous intéresse.  [...]

[Biologie Moléculaire] transfection lipofectamine LTX and PLUS reagent invitrogene

Pour 100µL de milieu de transfection (ADN-lipo-Plus reagent dans de l'opti-MEM), je te conseille d'ensemencer tes cellules la veille dans 1mL de milieu (si tu cultives en plaques 24 puits, à adapter sinon) de manière à ce qu'elles soient à H80% de confluence le lendemain, puis le lendemain pendant l'incubation de tes complexes, de laver ton puits avec du PBS, de remettre 400µL de milieu de culture sans serum puis d'y rajouter tes 100µL de milieu de transfection (limiter le volume pendant la transfection permet de réduire le temps que mettront les liposomes pour sédimenter).  [...] Avant tout, une question peut-être bête mais je ne connais pas bien les gènes que tu étudies. Ta mort cellulaire n'est-elle pas justement dûe à la surexpression des protéines que tu veux étudier.  [...]

[Biologie Moléculaire] technique PIFE + fluroscence

Voila je me demandais qu'elle était la différence entre la méthode PIFE (Protein Induced Fluorescence enhancement) et une expérience de fluorescence sur une plaque 96 puits. Le but étant d'observer l'interaction entre 1 ARN et une protéine. Ce que je sais c'est qu'avec la PIFE, plus le pic de fluorescence est élevé plus l'interaction est importante.  [...] Du coup la PIFE serait une méthode quantitative avec une bonne sensibilité et la technique de fluorescence sur plaque 96 puits serait donc moins sensible. Par contre avec cette technique (96 puits) on peut quand même quantifier la fluorescence pour en déterminer l'interaction d'une protéine vis à vis d'un ARN ou ça reste une méthode qualitative.  [...]

[Biotechnologie] méthode de Bradford

J'ai une toute petite question sur le principe de cette méthode. Lorsqu'on veut par exemple quantifier les protéines d'une solution à l'aide d'une gamme de sérumalbumine bovine prédéfinie. Où met on le Bradford est ce qu'il est sur toute la plaque de micotitration ou bien il doit être mélanger dans chaque puits avec le sérum albumine et notre solution à titrer.  [...] Le bradford est un réactif, il doit être ajouté dans chaque puits contenant une protéine à doser, que ce soit l'étalon (la BSA) ou la solution à concentration inconnue.  [...]