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Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

Plasmide et gène LacZ

La première étape de l'utilisation des plasmides est la détermination des bactéries transformant (qui ont intégré un plasmide non recombinant) et des bactéries transformant recombinant (qui ont intégré des plasmides recombinant, i.e. contenant le gène luc), par rapport aux bactéries non transformant.  [...] Une fois les bactéries sélectionnées, il va falloir purifier les vecteurs, afin que l'ADN soit exempt de toute protéine, de tout ARN ou d'une quelconque contamination chimique. Puis, avant de commencer les expériences proprement dites, on transfecte les plasmides dans les cellules qui nous intéressent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle).  [...] Comme tu l'as dit. plasmide + ligase = voir les plasmides mal digérés, mal déphosphorylés. Si la ligase est mauvaise, un faible nombre de bactéries transformées sera peu représentatif de l'efficacité réelle de la digestion et surtout de la déphosphorylation. On peut alors partir sur une fausse piste.  [...]

[Biologie Moléculaire] Colonies de bactéries

Je suis actuellement entrain d'effectuer une modification de BAC par recombinaison homologue dans la bactérie DH10B. Je viens de transformer mes bactéries qui contiennent le BAC avec le plasmide contenant la séquence que je veux insérer dans ce BAC. Après l'electroporation, mes bactéries ont poussées sur un milieu contenant des antibiotiques appropriés montrant que certaines ont bien intégrer le plasmide et que celui ci a du s'intégrer dans le BAC (le plasmide contient une origine de réplication qui ne lui permet pas de se répliquer de façon autonome dans ce type de bactéries).  [...] La strategie est generalement de transformer en meme temps le plasmide a modifier et l'insert, et dans des proportions ou une bacterie sera transformee par un seul plasmide a la fois. Pas mal de mise au point en perspective.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination transformation

Je ne récupère aucun ADN plasmidique...il n'y a pas forcément d'ADN plasmidique dans des bactéries... Ce qui veut dire que ma contamination provient d'une bactérie résistante à l'antibiotique mais qui n'a pas intégrer un plasmide parasite issu du labo porteur de la résistance Ampi.  [...] non pas du tout...je ne veux pas intégrer le gène de résistance. En fait j'ai des bactéries résistantes à l'ampi qui poussent sur mes boites ainsi qu'en culture liquide et qui n'ont rien à voir avec mes plasmides ou d'autres plasmides manipulés au labo.  [...]

Intégration dans un plasmide

C'est pour cette raison qu'on utilise un vecteur d'ADN circulaire pour introduire un gène dans une bactérie. Ce vecteur est souvent un plasmide modifié (avec de nombreux sites d'intégration possibles, un promoteur fort avant ces sites, des gènes de sélection pour pouvoir distinguer les bactéries qui ont intégré le plasmide...).  [...] Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

Pour choisir un vecteur, il te faut regarder la force de l'origine de réplication (qui détermine le nombre de copies de plasmide dans la bactérie), les résistances aux antibiotiques (sélection des bactéries intégrant le plasmide), la présence d'autres marqueurs de sélection comme la beta-galactosidase, le type de système d'expression (promoteur euca/procaryote, RBS pour traduction chez procaryote,  [...] Pour ce qui est finalement du choix du vecteur, il te faut un vecteur contenant une origine de réplication procaryote, un gène de résistance à un antibiotique et pourquoi pas le gène beta-galactosidase à cheval du polylinker (cela permet de sélectionner les bactéries qui ont un plasmide ayant intégré un insert), et bien sûr le polylinker.  [...]

Extraction d'acides nucléiques

J'aurais voulu connaître succinctement les principes généraux (et pas les protocoles..) des méthodes d'extraction de l'ADN plasmidique, ADN totaux, ADN chromosomique, ARN. Parmis les ARN peut on séparer les ARNr, ARNt et ARNm.  [...] Sinon a partir de la solution (extraction à partir de cellule de mammifere, levures etc..) de départ tu transformes des bacteries pour isoler le plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.  [...] J'ai obtenu des colonies de bactéries qui ont poussé avec ce plasmide. Ensuite j'ai prcoédé à des recombinaisons chez la levure et j'ai électroporé les YACs extraits de la levure dans des E. coli DH10bêta. Et là j'ai des résultats bizarres, je ne sais pas si je n'ai pas perdu l'insert, car j'avais des colonies positives (criblage pcr) et après une maxi prep, j'ai obtenu de bonnes quantités d'ADN mais plus de réponse par PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Système Toxine-Antitoxine

Un système toxine-antitoxine (TA) est particulièrement utilisé par les bactéries et les archeas, en particulier pour prévenir la perte d'une résistance au fil des mitoses. Le système TA étant composé d'une toxine relativement stable et d'une antitoxine instable (mais en nombre suffisant pour inactiver la toxine en temps normal), si le plasmide portant le gène responsable de ce système est perdu ou mal copié avant la mitose, la cellule fille qui n'en contiendra pas va mourir, car l'antitoxine va se dégrader, mais pas la toxine.  [...] Les systèmes TA peuvent,en effet, se trouver sur des plasmides mais aussi sur d'autres éléments génétiques mobiles tels que dans des phages ou des transposons. Ils peuvent aussi se localiser sur le chromosome. Ceci suggère donc une dissémination par transfert horizontal.  [...]