• Forum - Copies, Plasmide, ADN

Préparation d'ADN plasmidique

Calculer le volume V qui a été utilisé au début de l'expérience pour préparer une quantité totale de 10ug d'ADN plasmidique dans 1mL.  [...] 1unité de DO=10^9bactéries. l'ADN est plasmidique. temps de regénération de la culture =37min. taille plasmide=2,7kb. taille d'une bactérie=1*0,4um². nombre de copies du plasmide dans la bactérie=500. nombre avogadro=6.10^23.poids moléculaire d'un nucléotide=330.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quantité totale de plasmide

Dans un premier temps, vous devez réaliser l'extraction des plasmides à partir de culture de bactéries. Pour chaque culture (A ou Amut), vous disposez de 12 ml contenant 3 × 10 puissance neuf bactéries par ml.  [...] Chaque bactérie contient 50 copies d'ADN de plasmide d'une taille De 3500 paires de bases ( même taille pour A et Amut). Le rendement de l'extraction est de 75 %.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

edit. vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ).  [...] IngDr a raison, tu peux vérifier tout ça avec un gène de ménage. Tu peux même le cloner dans un plasmide et ainsi déterminer un nombre de copies d'ADN par volume. Tu réalises ensuite une gamme et ainsi tu pourras poser des valeurs sur l'expression de ton gène grâce à la Q-PCR et ton gène de ménage.  [...]

Normalisation RT-PCR quantitative

Souvent, les gammes sont faites avec des plasmides portant la cible. Comme tu connais exactement la séquence de ton plasmide, ou au moins son nombre de bases, tu peux calculer sa masse moléculaire, et de là, en déduire le nombre de copies de plasmide par mg d'ADN.  [...] Personnellement, je trouve que cette méthode a des limites. les plasmides sont si petits qu'il faut utiliser les concentrations très faibles d'ADN (fg). Dans ce cas, l'ADN a tendance au bout d'un moment à se coller aux parois des tubes en plastique (charges électrostatiques) dans lesquels tu stockes ta gamme.  [...]

[Biochimie] qPCR en temps reel (absolu vs relative)

Grace a cela je pourrais calculer successivement le deltaCt (qui me permet une normalisation) puis le deltadeltaCt et connaitre ainsi le nombre de copies en plus ou en moins de mon gene teste dans les conditions experimentales par rapport aux conditions standard en calculant E a la puissance deltadeltaCt.  [...] * Si je veux ramener cela non pas a un simple nombre de copies en plus ou en moins par rapport a la condition standard, je vais devoir faire des dilutions (de plasmide + gene teste ou d'ADN genomique ou autre...) afin de faire coincider les valeurs de Ct a une concentration etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

La Q PCR c'est établir une gamme étalon d'un ADN controle ( Quantité d'ADN au départ connu) généralement un plasmide avec 1000, 10 000 100 000 et enfin 1 000 000 copies et définir pour chaque quantitées le nombre de cycle néssaires pour avoir un signal différent du bruit de fond (le cT) celui-ci est donc inversement proportionnelle à la quantitée d'ADN du départ.  [...] Ton plasmide, comment est tu sur qu'il est à 1000 copies et pas 1500 ou 2000 copies. Dans ce cas tu es relatif à ton nombre de copies qui n'est pas si absolue que ca.  [...]

[Génétique] Conséquence de l'intégration d'un vecteur dans une bactérie

En fait les plasmides portant les résistances sont multi-copies. Ce qui veut dire que dans chaque bactérie il y a un nombre très important de plasmides (100 à 300 je crois). C'est ce qui est intéressant quand on veut multiplier un fragment d'ADN.  [...] Cela ne l'est pas dans une population de milliards de milliards de cellules se reproduisant vite, une petite différence au départ peut conférer finalement un avantage non négligeable. Sans parler des questions de plasmide multi-copies. C'est un principe général, on enlève la pression de sélection, le gène de résistance subit la dérive, voire même est contre-sélectionner si son maintien/ expression a un coup.  [...]

Qcu

L adn chromosomal et l arn ribosomial 23s d'E.Coli ont comme poids moléculaire respectivement 2,2 109 et 1,1 106. Approximativement 0,3% de l Adn total sont hybrides avec cet Arn 23s. Donner le nombre de copies de gene de l Arn 23s que contient l adn d'E coli.  [...] 'ai pas compris. est ce que tt les copies de cet ARN vont se coller sur ube seule molecule d'ADN. dans ce cas ne serait pas insuffisant puisqu'il est si court.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Je travaille avec de l'ADN genomique, et j'ai pas le nombre de copies desolee. C'est aussi important de savoir le nombre de copies.  [...] Ba si y en a pas assez tu peux avoir une amplification mais tu le vera pas sur le gel. En plus si c'est de l'ADN génomique, ta concentration est élevé mais ton nombre de copie beaucoup moindre. Et inversement, petit fragment avec concentration identique, sa fait beaucoup de copies... Tu est à combien en MgCl2.  [...]

[Biologie Moléculaire] Encore de la Q-PCR : quantification absolue maintenant

Pour mes réalisations de Q-RT-PCR, ma gamme je la réalise avec un palsmide dont je connais la taille, la concentration... et bien sur dont je possède un couple de primers permettant d'amplifier un fragment de moins de 200pb de ce plasmide.  [...] A partir de là je fais une gamme dans laquelle je connais le nombre de copies de mon plasmide dans chaque tube. (100.000.000 copies, 10.000.000 copies, etc jusqu'à 1 copie).  [...]