• Forum - Contrôle, Positif, Plasmide

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

j'ai d'abord essayé de transformé 1µL du milieu de ligation pour 25µL de bacteries puis 10µL pour 50µL de bacteries mais aucune pousse bacterienne dans les deux cas, le controle positif fonctionne, donc les bacteries que j'ai rendu compétentes sont bien apte a recevoir le plasmide.  [...] Mon controle positif lors de la transformation est le plasmide contenant l'insert (non digéré) c'est ce plasmide que j'ai digéré pour isoler l'insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

Si j'ai bien compris le TP (en anglais...) vuque le test positif n'a pas marché avec pT7Blue plasmide, on a donc utiliser pBluescript, mais je n'en suis pas sure... En cas de controle positif du kit commercial negatif, il faut donc changer le vecteur A quoi peut etre dut cet echec.  [...] le controle positif fut fait au debut du TP... mais il ne marcha pas avec le plasmide pT7Blue, quelles sont les raisons possibles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème transfo...

* toutes les cellules électrocompétentes ont été contaminées par une autre sauche possédant un plasmide portant un gène de résistance à la kana. il faut donc que j'étale sur boîte LB + kana des bactos non transformées et voir ce que ça donne, non.  [...] Ca n'a rien a voir avec de la SF, il y a meme fort a parier que les origines de replication des plasmides de bacillus soient completement differentes des origines des plasmides de coli. Ca demande a etre verifie, mais si ton plasmide n'a pas une origine coli, ca risque de poser probleme.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR: dépôts qui restent dans les puits lors de la migration

Le problème que j'ai est que je ne parviens pas à obtenir de bande à découper sur mes gels (1% agarose dans TAE). mes dépots semblent rester dans les puits, quelque soit la condition considérée.   [...] Piste 3. Controle positif (50ng du plasmide contenant le gène wt). On y devine bien une bande au bon PM, mais celle-ci reste bien trop faible pour être purifiée (et le but est de purifier la bande pour l'ADN patient).  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...] ...Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de PCR

On a fait amplifier de l'ADN de certains de nos échantillons et on faisant migrer les produits sur gel, il s'est avéré que y a eu contamination (révélation d'une bande sur gel correspondant au contrôle négatif).  [...] Après il est aussi possible que les contaminations observées ne proviennent pas d'un des réactifs mais simplement du fait de la manipulation de l'ADN a proximité du contrôle négatif. Ca peut expliquer pourquoi dans une PCR sans ADN tout soit blanc.  [...]

[Biologie Cellulaire] Induction d'apoptose 3T3

Encore juste une question. il se trouve qu'on ne dispose que de 2 cryotubes de cellules, et qu'on n'aura pas les moyens d'en congeler avant de commencer les manips (planning très serré et pas encore de congélateur -80°C), donc il sera difficile de sacrifier un de nos tubes pour faire le contrôle positif de la manip.  [...] - je souhaite effectuer une manip de détection Annexine V / PI par cytométrie en flux. Je cherche donc à avoir un contrôle positif pour chacun de ces paramètres. Si j'ai bien compris, il me suffit d'avoir des cellules nécrotiques, ce que je cherche donc à obtenir.  [...]

[Biotechnologie] Résultats d'un criblage biologique...

Quoi qu'il en soit, lorsqu'on fait un crible, la valeur du signal n'est pas importante. On compare toujours la valeur obtenue avec l'inhibiteur par rapport à un contrôle positif (sans inhibiteur - signal max) et un contrôle négatif (sans ligand marqué - signal min) et on obtient ainsi un pourcentage d'inhibition.  [...] On compare toujours la valeur obtenue avec l'inhibiteur par rapport à un contrôle positif (sans inhibiteur - signal max) et un contrôle négatif (sans ligand marqué - signal min) et on obtient ainsi un pourcentage d'inhibition.  [...]

[Microbiologie] ligation clonage

merci pour votre coopération, juste j'aimerais bien savoir quand est ce que je peux utiliser les ratios 1.1, 1.5, et 1.3 (insert/vecteur) comment je peux savoir si les bouts sont cohésifs ou pas sachant que j'ai utilisé ECOR I pour traiter mon plasmide et l'ADN.  [...] Par contre, tu risques d'avoir pas mal de faux positif avec ta technique car le plus simple pour la ligase que tu vas mettre, c'est de recoller le plasmide avec lui même (et donc ton insert sera pas dedans). Donc, ce qui faut que tu fasses, c'est d'essayer de mettre le plus d'insert possible dans ton tube de ligation (plus y a d'insert, plus la chance qu'il soit mis dans le plasmide est grande).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

Déjà une chose, ça a pris plus de temps que d'habitude pour avoir des colonies. Le contrôle positif fait avec un de mes vecteurs et les cellules a donné des colonies après une nuit (normal). Pour mes plaques de transformation, j'ai du attendre 1 jour pour avoir des coloniees bien visibles.  [...] J'ai purifié ma ligation des éventuels sels présents et j'ai refait l'électroporation et de nouveau Arc. Ce n'est que lorsque j'ai dilué 100 x le contrôle positif que je n'ai plus eu d'Arc. Il semblerait que ça soit un problème de concentration d'ADN... Mais comment leur contrôle positif pourrait être trop concentré.  [...]