• Forum - Contrôle, Plasmide, Transformation

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Pour ma ligation j'ai aussi utilisé un controle plasmide sans insert + ligase mais aucune pousse bacterienne apres transformation.  [...] Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

Je refait le manip (dépuis le pcr des colonies positifs, avec comme controle le plasmide vide) pour confirmer que je me suis pas trompé de colonies mais ça donne toujours la même chose. Donc je commence à penser que les bactéries rejettes mon insert et seulement quand celui-ci est dans le sens que je veux.  [...] Oui à chaque fois que je fait le criblage, je fait toujours un contrôle négatif plasmide seul et qui me donne aucune bande (comme j'utilise un amorce dans le plasmide et un autre dans mon insert).  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

Fais tu une transformation contrôle avec l'insert seul déphosphoré + ligase Y a-t-il autant de colonies que dans plasmide + insert.  [...] Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...] ...Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

es-tu sûr que ta transformation s'est bien faite Qu'as-tu utilisé comme contrôle (contrôle d'activité de la ligase, contrôle de clivage effectif par les deux enzymes, contrôle de transformation).  [...] J'ai d'une part fait une ligation avec mon plasmide(digéré), l'enzyme et sans mon insert et d'autre part le plamide,l'insert et l'enzyme je n'ai donc pas de contrôle plasmide liguer par contre je ne pense pas que se soit forcement la transformation vu que d'habitude je n'ai pas de problemes mais j'ai tout de même un petit doute sur la ligation avec la TAKARA qui préconise 5min à 25°C ou 30min à 16°C j'ai donc essayé les deux methodes et j'ai même prolongé à 2h30 à 16°C donc est ce que quelqu'un a déjà eu un soucis avec cette enzymz car les temps de ligation me semblent courts...sinon je ne vois pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

La premiere est de verifier que tes cellules sont competantes (transformation d'un plasmide circulaire connus ~ 50 ng, genre pUC, pBR, etc).  [...] 1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...]

[Microbiologie] Plasmides incompatibles?

) qu'a partir du moment qu'on arrive a faire la transformation, qu'on maintient le plasmide avec des antibio, et qu'il n'est pas incompatible avec des plasmides eventuellement deja present dans les souches naturelles, il n'y a aucun probleme.  [...] Je suis contre ce qu'elle dit, car je crois (mais dites moi si c'est faux.) qu'a partir du moment qu'on arrive a faire la transformation, qu'on maintient le plasmide avec des antibio, et qu'il n'est pas incompatible avec des plasmides eventuellement deja present dans les souches naturelles, il n'y a aucun probleme.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

Pour commencer, je pense pas qu'il sagit de la ligase car a chaque ligation jeffectue un controle ligase. j'utilise le vecteur simplement digéré auquel j 'ajoute la ligase pour controler la qualité de la ligase car le plasmide simplement digéré se ferme facilement avec la ligase et si aprés transformation je trouve des colonie qui poussent sur le milieu additionné d antibiotique c'est que la ligase est OK et c'est mon cas.  [...] Par ailleurs j aimerais savoir si on peut controler le produit de ligation sur gel avant de transformer pour comprendre et pouvoir trancher entre probleme de ligation ou probleme de transformation et est ce que c'est normal qu'un clonage soit aussi dure à realiser ça fait qd mm 2 mois hihihi.  [...]