• Forum - Conditions, Hybridation, Température

Conditions experimentales PCR, test primers !

Mon travail consiste a tester des couples d'amorces (primers F/R) afin de determiner les conditions experiementales pour leur utilisation. J'ai testé ces amorces avec une temperature d'hybridation standard donnée par les differents protocoles de PCR. 55°(diferente de celle indiquée sur les etiquettes des tubes des amorces) et la plus part de mes couples d'amorces ne donne pas de signal ou de signal specifique.  [...] . toutes vos idées à propos de ce que je fais me seraient utiles. determiner les bonnes conditions experimentales pour l'utilisation de differentes couples d'amorces (primers), comment savoir la bonne temperature d'hybridation, comment savoir combien de cycles de PCR pour chaque amorce.  [...]

[Biologie Moléculaire] les résultats de migration sur gel d'agarose

Cherchez de meilleure conditions (qualité de la polymérase, température d'hybridation) ou changez de primer.  [...] Il va falloir nous en dire plus sur les conditions. vous amplifiez quoi a partir de quoi (génomique, ADNc ) Et vous vous attendriez a voir quoi.  [...]

optimisation pcr quantitative temps réel

je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.  [...] Tu peux travailler sur tes conditions de cycle. température d'hybridation plus haute, montée progressive de la température pour arriver à 72 °C, voire même travailler avec des amorces plus longues avec des Tm de 60-62°C et travailler en cycle avec 2 températures.  [...]

Mutagenèse dirigée

le premier fois pour PCR, j'ai fait exactement les conditions de PCR propose par le kit, 95C denaturation 2min au depart, 60C temperature d'hybridation et 68C temperature d'elongation pendant 5min, 18 cycles au total. Rien obtenu apres la transformation, j'ai verifie le produit de PCR par gel agarose, rien du tout.  [...] le deuxieme fois j'ai modifie la temperature d'hybridation pour 68C, et le temps d'hybridation et d'elongation au total 12 min, toujours rien obtenu.  [...]

séquences d'un couple d'amorces pour pcr

Theoriquement tu selectionnes des regions de tailles comprises entre 18 et 25 nt qui ont une temperature d'hybridation. a 60°C idealement et dont le % en GC est aux alentours de 50% (conditions ideales). Ensuite faut s'assurer que ta sequence ne fait pas de structures secondaires, ne s'apparie pas ailleurs et ne forme pas de duplex avec ton deuxieme oligo.  [...] Enfin il est preferable que l'exremité 3' de l'oligo (la ou commencera la reaction de polymerisation par la Taq) soit un G ou un C. pour l'extremité 5' on se moque de savoir ce qu'il y a. a l'extreme limite tu peux meme rajouter (en plus des 22nt de ton amorce) 50nt qui ne s'apparient pas du tout a ta sequence et qui seront donc insérés dans ton produit de PCR final.   [...]

[Biologie Moléculaire] primer dimer

La formation de dimères est due à des conditions de PCR trop permissives, après évidemment un design d'amorces non optimum. Les paramètres que l'on peut modifier sur un qPCR pour diminuer les dimères sont la température d'hybridation (la diminuer), puis la concentration en MgCl2 (la diminuer), et évaluer le ratio sonde/amorces en concentration.  [...] Si tous ces essais ne changent rien et que la présence de dimère reste dommageable pour la PCR (car un dimère en Sybr Green, ça se voit souvent, mais en TaqMan, beaucoup moins) avec une éventuelle inhibition ou limitation de la réaction de PCR par la réaction parasite, alors il faudra repenser le système d'amorces et repartir sur un nouveau design.   [...]

[Biologie Moléculaire] détection de gènes multicopies

Tout d'abord j'avais penser faire une digestion de mon adn, puis faire migrer, suivi d'une hybridation avec une sonde radioactive et j'aurais alors pu voir si une ou plusieurs bandes s'allumaient. Malheureusement cette technique nécessite une grande quantité d'adn que je n'ai pas.  [...] Pour le principe de la FISH interphasique et bien déjà on peut la faire sur n'importe quel tissu. On dénature la lame avec le matériel génétique et les sondes puis il y a hybridation des sondes spécifiques du gène en question (locus spécifique) sur l'ADN simple brin (en parallèle on contrôle les conditions dénaturantes et la température).  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : bandes aspécifique et température

J'ai commencé avec une température d'hybridation volontairement inférieur à celle du Tm de mes amorces car j'ai amplifié un autre insert dans le même programme de PCR.  [...] J'étais un peu perturbé d'obtenir le résultat inverse que celui auquel je m'attendais (augmentation de la température d'hybridation entrainant l'apparition de bandes aspécifiques...) mais l'essentiel est d'avoir une condition qui fonctionne bien.  [...]

[Biologie Moléculaire] Notion de stringence d'hybridation

je souhaiterais avoir quelques précisions sur la notion de stringence d'hybridation. Tout d'abord, qu'est-ce que celà signifie exactement Pourquoi dit-on que la stringence d'une solution augmente lorsque la concentration en sels diminue (et inversement).  [...] Pour résumer, en conditions stingentes (température élevée, faible concentration en sels), il est plus difficile d'hybrider deux brins d'ADN. Mais utiliser des conditions plus stringentes permet, comme le disait Enjoys, d'augmenter la spécificité de l'hybridation.  [...]

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]