• Forum - Concentration, Plasmide, ADN

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

Sachant que Rendement = (Concentration après purification) / (concentration avant purification), il me manque donc la concentration avant. On connait la concentration d'ADN (donc celle du plasmide) présente initialement. Cependant, pour connaitre celle des fragments présents (donc l'extrémté 5', après digestion) j'essaye cette formule. (Concentration ADN * (784/5484)). Donc.  [...] Je crois, la concentration initiale de l'ADN plasmique initiale EST juste la concentration initiale du fragment digéré dont tu as besoin, parce que pour un plasmide, il n'existe qu'UN fragment de 784 bp qui est celui que tu cherches (la moitié 5' du gène, oui ).  [...]

[Biochimie] qPCR en temps reel (absolu vs relative)

Grace a cela je pourrais calculer successivement le deltaCt (qui me permet une normalisation) puis le deltadeltaCt et connaitre ainsi le nombre de copies en plus ou en moins de mon gene teste dans les conditions experimentales par rapport aux conditions standard en calculant E a la puissance deltadeltaCt.   [...] * Si je veux ramener cela non pas a un simple nombre de copies en plus ou en moins par rapport a la condition standard, je vais devoir faire des dilutions (de plasmide + gene teste ou d'ADN genomique ou autre...) afin de faire coincider les valeurs de Ct a une concentration etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Une question. quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****).  [...] Si tu mets 1 unité d'enzyme et que la réaction fonctionne à 100%, tu auras 1microgramme de digéré. Je te conseille de mettre plutôt 2 unités avec 10 microlitres de ton plasmides (1,5mg), tu devrais avoir largement assez de matériel pour le clonage qui suit.  [...]

[Biologie Moléculaire] Maxiprep

Moi je pense à l'étape final,j'ai peut être fait une erreur que je fais pas d'habitude,c'est la resuspension j'ai vraiment insisté sur la resuspension peut être ai-je cassé mécaniquement mon plasmide.  [...] Pour la miniprep il n'y a pas de soucis. Le soucis est avec la maxiprep ou j'ai une concentration de l'ordre de 500ng/µl ce qui est normale par contre ce qui est pas normale c'est lorsque je dépose ma maxiprep pour vérifier la qualité et là problème.. j'ai une bande en haut du gel c'est peut être de l'ADN gémomique et je n'ai pas de plasmide par contre.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

Il est très possible de cloner un fragment d'ADN génomique amplifié par PCR dans un plasmide extrait mais non amplifié, mais il est préférable de déterminer la concentration approximative disponible de ces 2 olécules avant de les utiliser.  [...] Personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais je passe par une etape de purification sur colone ce qui me permet probablement de m'en debarasser (de la meme maniere que les fragments d'ADN clonés apres migration sur un gel d'agarose+BET. Ceci dit, il en faut vraiment pas bcp, car meme a tres faible concentration ca inhibe tres fort la digestion.  [...]

[Génétique] plasmide ADN distinct de l'ADN chromosomique

j'ai pas bien compris la définition du plasmide,surtout quand ils disent que c'est une molécule d' ADN distinct de l'ADN chromosomique.  [...] Les plasmides sont des molécules d'ADN, généralement circulaires, et capables de réplication autonome, que l'on trouve surtout chez les bactéries. Ils existent dans le cytoplasme en plus du chromosome cellulaire (d'où le distinct dans ta définition) comme tu peux le voir ici.  [...]

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Bonjour, je voudrais savoir s'il existe un moyen de calculer la concentration d'ADN dans une solution avec comme seule information la masse d'unités osidiques que contient celle-ci (les bases, sucres et phosphates ont été séparés et sont toujours présent dans la solution).  [...] Comme on me demande la concentration je présume que je dois d'abord calculer la masse de plasmide ainsi que sa masse molaire, et en déduire la quantité de matière de plasmide, et diviser par le volume. Suis-je ok cette fois ci.  [...]

[Biologie Cellulaire] transfection

pas top). De plus, le plasmide n'est généralement pas très concentré. enfin, tu peux vérifier tout ces paramètres en dosant au nanodrop (ou lecture de l'absorbance dans l'UV et proche UV) avec le rapport 260/280 (protéine/ADN).  [...] Nous utilisions du glycerol pure et stérile (99%), pour une concentration finale de 25% (jusqu'à 50% pour les bactéries fragile, c'est à dire avec un grand plasmide (entre 15 et 20kpb).  [...]

[Microbiologie] Culture bactérienne troublante

j'ai une grande question qui a plus ou moins a voir, est ce que le plamide que l'on transfecte à la bactérie risque de tuer la bactérie, je m'explique, dans vos expérience il semble que la concentration de vos plasmide soit trop important mais ce peut il que le plasmide réagisse mal avec l'adn bactérien et soit léthal.  [...] Si la concentration de plasmide est trop élevée, on observe de la toxicité pour les bactéries. Cela dépend de la taille des plasmides.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.  [...] Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre.  [...]