• Forum - Concentration, Plasmide, ADN

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Pour concentrer ton ADN, tu peux éventuellement utiliser un désicateur pour évaporer un peu d'eau de ton produit de purification d'ADN plasmidique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle).  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.  [...]

[Génétique] Plasmide

le plasmide se religue sur lui même et reforme un plasmide circulaire. C'est une réaction intramoléculaire qui est favorisée à faible concentration.  [...] Deux plasmide digérés, possédant donc des bouts cohésifs équivalent se ligue entre eux. Tu formes alors des concatémères. C'est une réaction intermoléculaire qui devrait être favorisée par l'augmentation de la concentration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de PCR

Nous sommes repartis d'une plasmide de cet été en faisant un gradient de température et de concentration et tout a fonctionner, donc nous l'avons fait avec nos ADNc (qui fonctionner cet été) et nous avons eu que des smears.  [...] Pour ma part, ce même probleme m'est arrivé sur une pcr classique. Il a été résolu tou simplement en changeant mes amorces. Ou tu peux aussi essayer de diminuer tes concentration en MgCl2( sa c la solution pour le même probleme d'un copain). salut.  [...]

[Biologie Moléculaire] Créer un plasmide...?

Sauf erreur de ma part (mais j'en suis presque sur), Craig Venter n'a pas cree un genome complet, il s'est contente de le re-assembler et de le mettre dans une cellule vide puis de le re-activer. Tu veux reellement creer un plasmide c'est a dire sans utiliser d'ADN deja existant A mon avis le plus simple est de faire synthetiser des oligos d'une centaines de pb, de les cloner bout a bout dans un plasmide connu, puis de virer la partie connue et de re-liguer ton super plasmide tout nouveau sur lui meme.  [...] Perso j'ai déjà créer des petits morceaux d'ADN double brin, à partir d'amorces synthétisées de façon chimiques. C'est de la PCR assemblage. J'imagine que si j'en avais ligé les extrêmités, j'aurai pu créer mon plasmide (pJmbo 1.0).  [...]

[Biologie Moléculaire] Transformation chez la bactérie ?

Si ca n'est pas n'est pas un plasmide, il peut être intégré de facon site-spécifique, si l'ADN en question contient une séquence particulière homologue de certaines régions du chromosome bactérien (attention, ca n'est pas un crossing-over. ce terme est réservé à la recombinaison homologue lors de la méiose chez les eucaryotes uniquement).  [...] Mais pour être sûr d'avoir bien compris, quand il s'intègre par hasard (donc pas de recombinaison homologue) cela signifie que si le chromosome bactérien a une taille de 100 bp (je sais que c'est beaucoup trop petit mais cela n'a pas d'importance ici) et que le fragment d'ADN à incorporer possède une taille de 10 bp, alors la taille finale sera de 110 bp (et non de 100 bp comme cela serait le cas s'il y avait recombinaison homologue).  [...]

[Génétique] pb clonage moléculaire

Traitement de l'ADN linéarisé du plasmide vecteur avec la phosphatase alcaline qui enlève les groupes 5' phosphate terminaux évité la recirculation du vecteur et la formation de dimères de plasmide. Après ce traitement, on puisse donc ajouté l'insert.  [...] Les cellules de Ecoli et l'ADN plasmidique interagissent de façon productive en présence d'ions calcium et à base Température (o-5°C).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination transformation

J'ai fais une transformation en bactéries Top10F' pour effectuer une recombinaison homologue entre un plasmide conférant une résistance ampicilline et un ADNg. A l'issu de la transformation de petites colonies sont apparues sur la gélose après 24h d'incubation...jusque là tout est normal.  [...] Je ne récupère aucun ADN plasmidique...il n'y a pas forcément d'ADN plasmidique dans des bactéries... Ce qui veut dire que ma contamination provient d'une bactérie résistante à l'antibiotique mais qui n'a pas intégrer un plasmide parasite issu du labo porteur de la résistance Ampi.  [...]

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.  [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.   [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

La ligation de l'insert s'est fait au niveau du gène lacZ d'un plasmide. On sélectionne les clones par ensemencement sur différentes boites.  [...] .. Il ne faut pas oublier non plus que l'IPTG est un inducteur plus fort que le lactose. Sans parler que si tu as juste un plasmide avec lacZ dessus, mais un opéron non fonctionnel sur le chromosome, tu peux toujours espérer que le lactose entre dans la cellule.  [...]