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Marquage Annexine V/ PI Cytométrie: concentration cellulaire

A votre avis, dois-je re-suspendre chaque échantillon de façon à ce que chacun d'entre eux soit à une concentration de 10^6 cellules vivantes (ou vivantes et mortes non préférentiellement), ou devrais-je tous les re-suspendre dans le même volume (calculé par exemple à partir du contrôle positif), afin de conserver une idée de la proportion de cellules vivantes/mortes.  [...] La concentration que te donne le kit est pour un marquage optimal, à priori 10^6 cellules totales/ml pour faire ton marquage dans 100µl, s'il y a trop de cellules le marquage peut perdre en efficacité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marquage Dig en Klenow, concentration de réactifs

je veux dire par là, pour la DIG-11-dUTP, tu as 125 nmol dans 125 µl Ou tu as une concentration de 125nM (nmol/L) Dans le premier cas, pas de problème. Dans le second, tu as une concentration plus faible, donc il te faut concentrer la solution (ou en acheter une nouvelle).  [...] Où Ci = concentration initiale de ton composé, Vi son volume initial (ce que tu veux savoir), Cf sa concentration finale (ce que tu désires avoir) et Vf le volume final (le volume dont tu as besoin pour ta réaction et un petit peu plus).  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme de signal southern

J'ai essayé plusieurs choses, augmenter les concentrations, changer tout mes tampons, changer la sonde a marquer, changer le kit de marquage, utiliser une sonde purifiée par HPLC.  [...] Oui j'ai essayé de varier les concentrations des ADN a utiliser et j'utilise également ma sonde à la concentration optimum.  [...]

gel shift : hhhheeeeelllp !!!!!!!

Je te recommande le kit de Roche DIG gel shift kit. J'ai eu a l'utiliser pendant ma these, le marquage se fait par la digoxigenine et la revelation est de type western blot. C'est un kit clef en main, c'est a dire que tu as tous les tampons pour faire ton shift de la permiere a la derniere etape.  [...] PS. 300 pb c'est bien, mais pas plus parce que apres tu seras obligee de diminuer la concentration d'acrylamide de ton gel, et que la manip va devenir tres delicate.  [...]

Random priming

si ça peut aider, personnellement, j'utilise des random primers pour faire des reverse transcription des ARNs totaux. Avec des oligosdT on ne sélectionne que les ARNs messagers qui sont polyA. J'ai aussi utilisé des randoms primers pour la synthèse de sondes radioactives pour Southern blot (produit PCR purifié puis marqué avec un kit dans lequel il y a ces randoms primers en présence de dNTPs radiomarqués).  [...] Mais du coup, la question que je me pose c'est. quel est l'intérêt de cette technique pour fabriquer des sondes marquées par rapport à d'autres plus anciennes comme la nick-translation par exemple (cassures dans l'ADN double brin puis repolymérisation avec dNTP radio par une ADN pol I) Il me semble avoir lu quelque part que l'idée d'utiliser ces amorces aléatoires avait créé une mini-révolution car cela se révélait beaucoup plus pratique mais je ne vois pas bien pourquoi, puisque ça fait exactement la même chose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Kit de purification ARN Qiagen

[Biologie Moléculaire] Kit de purification ARN Qiagen.  [...] J'aurais aimé faire appel à vos expériences sur les kit de purification Qiagen. J'utilise le Mini kit pour purifier des ARN marqué avec de la cyanine (marquage Agilent). J'aurais souhaitais savoir si vous aviez déjà rencontré des problèmes avec les colonnes, perte de la totalité des ARN à purifier par exemple mais tout autres problèmes seraient les bien venus.  [...]

[Biologie Cellulaire] marquage TRAP

Voila je bosse sur les ostéoclastes et j'utilise un marquage TRAP pour les identifier. Or impossible de trouver le principe de ce marquage nul part, le protocole du kit me renvoie sur une publi écrite en 1962 à laquelle je n'ai evidemment pas acces.  [...] Alors si quelqu'un pouvait m'en dire un peu plus sur ce marquage, je lui en serais eternellement reconaissante.  [...]

[Biologie Cellulaire] substrat de la phosphatase alcaline

merci j'ai finalement trouvé le substrat et effectivement il faut être à un ph alcalin pour que le produit de réaction soit ionisé (ce qui lui donne sa couleur jaune). Mais je voudrais savoir si quelqu'un a essayé le traitement d'une labteck avec ce réactif et s'il est possible de voir ainsi l'activité de la phosphatase.   [...] Je n'ai jamais essayé, par contre j'ai fait l'expérience avec les peroxydases endogènes.. J'ai oublié de les bloquer avant mon marquage et elles ont magnifiquement catalysé le substrat. J'utilisais un kit classique de révélation, ce qui te permets d'etre dans les bonnes conditions de pH.  [...]

[Immunologie] marquage multiple en immunohistochimie

Voila je compte faire un double marquage en immunohistochimie. Pour le faire j'ai choisie le système de révélation enzymatique. AEC pour le premier marquage (peroxydase. ABC peroxydase kit) et le fast bleue pour le deuxième marquage (phosphatase alcaline.  [...] Je me demande s'il y a qqn qui pourrait me dire les raisons pour laquelle le AEC est peu utilisé et est ce que j'ai le bon choix et si c'est pas le cas puisse je utilisé le DAB avec le fast bleu dans le double marquage.  [...]

[Immunologie] Hybridation in situ: sonde ARN

Tout a fait, mais la longueur max a etre synthetisee est 100 pb. De plus la synthese d'une amorce de 100 pb avec une grosse purif, un groupement detectable et une quantitee sufisante pour la manip doit probablement couter plus de 400E (un clonage ne coute rien ).   [...] Enfin, ta sonde ne sera utilisable QUE pour la beta-actine. C'est pour ca que beaucoup preferent faire des clonages et marquer les sondes dans le labo. Le kit de marquage n'est pas tres cher et peut etre reutilise des dizaines de fois.  [...]