• Forum - Colonies, Bactéries, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Donc vérifier que tes bactéries sans plasmide sont bien sensibles aux deux antibios, et d'abord faire pousser les bactéries transformées sur strept, puis repiquer les colonies en les identifiant sur ampicilline, puis tester par miniprep celles qui ne poussent pas sur ampicilline.  [...] Le plasmide de départ est StreptoR et AmpR. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+amp, c'est que les bactéries ont intégré le plasmide natif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

1/ Calcule to efficacité de transformation, si elle est en dessous de 10^6 colonies /ug de pUC18 (ou un plasmide de petite taille équivalent), jette tes bactéries et reprépares-en d'autres (ou achètes-en d'autres). Je vois trop d'étudiants me dire j'ai transformé 1ug de plasmide et j'ai un tapis, donc mes bactos sont OK.  [...] Des bactéries à 10^4 colonies/ug donneraient aussi un tapis avec 1ug de plasmide, pourtant elles seraient impropre à la plupart des constructions.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...] Mon conseil est de modifier tes cycles de PCR pour améliorer ton amplification (je fais classiquement au moins 25 cycles). et il m'est arrivé de remplacer la pfu par la phusion de chez (Finzyme) qui amplifie 1kb en 15s. ce qui est appréciable pour les gros plasmides.  [...]

mode de resistance aux antibiotiques

L'existence des plasmides et leur rôle dans l'échange de gènes est non seulement démontrée, mais en plus ce fait est utilisé avec succès dans la réalisation de bactéries OGM. En effet les plasmides sont un des trois moyens en biotechnologies pour transformer une bactérie.  [...] celles qui ont incorporé le plasmide peuvent se développer et former des colonies. Et hop, on est certain à 100% que les bactéries qu'on prélève ont le plasmide en elles.  [...]

Plasmide recombinant

L'ampicilline est l'antibio classique qui permet de sélectioner les bactéries qui contiennent le plasmide quand tu les transformes (seuls poussent les bactos qui ont le plasmide). C'est l'étape de la contruction et de la sélection.  [...] cette sélection s'effectue en étalant les bactéries transféctées sur une boite d'agar contenant la Tet, toutes les colonies obtenues de cette façon contiennent un plasmide.ces colonies résistantes sont ensuites téstées pr leur capacité de croitre sur un milieu contenent l'Amp.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteurs, gènes et plasmides

en fait jinsere un gene viral, dans un plasmide -. selection du bon plasmide dans des cellules bacteriennes (a laide de la selection AB), mais l'expression final du gene que je recherche doit se faire dans des cellules animales.  [...] Par pression de selection AB sur les bacteries, je vais pouvoir selectionner uniquement les colonies bact qui ont integrer mon plasmide (qui a un gene re resistance a la selection).  [...]

Criblage

Dans la synthèse de l'insuline in vitro par exemple, on effectue un criblage des colonies blanches obtenues après ensemencement sur un milieu contenant le lactose. On rechercher les bactéries ayant un plasmide contenant le gène recherché mais le fait que ces colonies soient blanches, cela veut dire pas d'expression du gène de la beta-galactosidase et donc insertion du gène d'intérêt non.  [...] Si une colonie pousse, c'est qu'elle a bien reçu un plasmide. cet événement est séléctionné par un gène de résistance à un antibiotique présent dans le milieu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Les colonies de bactéries contenant un plasmide recombinant se différencient des autres colonies bleues par leur couleur blanche.  [...] Du coup...T2 contenant de la ligase, serait le témoin de ligation oui... Mais je ne vois pas en quoi il montre l'efficacité de la ligation, vu qu'avec ou sans ligase des colonies poussent. Tant que le plasmide est dans la bactérie en gros.  [...]

Plasmide et gène LacZ

Une fois les bactéries sélectionnées, il va falloir purifier les vecteurs, afin que l'ADN soit exempt de toute protéine, de tout ARN ou d'une quelconque contamination chimique. Puis, avant de commencer les expériences proprement dites, on transfecte les plasmides dans les cellules qui nous intéressent.  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

[Génétique] vecteur de plasmide

- des colonies bleues ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide mais pas l'insert puis que celle-ci a pu synthétiser de la B-galactosidase.  [...] - des colonies blanches ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide et l'insert puisque l'insert se retrouve en plein milieu du gène lacZ, il est non fonctionnel donc pas de synthèse de B galactosidase et donc pas d'interaction avec le substrat chromogène (X-gal).  [...]