• Forum - Colonie, Plasmide, ADN

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

Je dispose de deux colonies bactériennes une blanche et une bleue (ayant donc subi un criblage blanc-bleu) donc une ayant intégré l'insert au niveau du polylinker et l'autre non. Le plasmide originel faisait 3900 pb et l'insert 240. J'en déduis donc qu'une colonie blanche a un ADN de taille 3900+240 soit 4140 pb et une bleue de 3900 pb.  [...] Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Bandes d'ADN non amplifié??

J'ai effectué une PCR certaines amorces ont été révélées incompatibles chez certaines souches, cependant seul quelques souches montrent après analyse sur gel des amplifiats des bandes correspondant à l'ADN (vérifié par la taille correspondant à celle de l'ADN mis au départ), ma question est pourquoi cette bandes n'apparait pas chez les autres souches.  [...] La réponse la plus simple est que ces souches n'ont pas le fragment d'ADN que tu essaies d'amplifier. Quelle type de molécule supporte ce fragment (chromosome, plasmide) Est-ce une PCR colonie ou sur une extraction Il peut aussi s'agir de la présence d'inhibiteurs de PCR dans les extractions d'ADN des souches qui semblent négatives.  [...]

[Biologie Moléculaire] L'ADN plasmidique

Salut,afin d'extraire l'ADN PLASMIDIQUE un groupe de travail a inoculé 5ml de bouillon LB à partir d'une colonie isolée sur milieu gélosé ils ont incubé ce bouillon une nuit à37°C.  [...] L'incubation toute la nuit permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide (le plasmide se réplique dans les cellules et les cellules se divisent).  [...]

isolation d'un plasmide

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage).  [...] Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation et l'amplification ne possédent pas de plasmides... pour t'en rendre compte, fait, à partir d'une colonie, une culture de bactéries non transformées d'une part et transformées d'autre part... fait ensuite une miniprep d'ADN plasmidique.  [...]

[Biotechnologie] Méthode de purification de l'insuline recombinante

J'aurais besoin de votre aide. Je dois faire un dossier sur la synthèse d'insuline par génie génétique, j'ai pu faire tout le début de mon dossier mais je suis bloquée pour ma partie extraction et purification. Pour l'extraction c'est ok, mais la purification me pose des problèmes.   [...] Je vous explique vite fait le contexte, le gène de l'insuline humaine est placé dans un plasmide, ce plasmide dans la bactérie et après sélection de la bonne colonie de bactérie on place la solution bactérienne dans un fermentateur pour obtenir beaucoup d'insuline, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] le clonage impossible, ou comment se prendre la tete...

Comme toi je digère mon plasmide avec 2 enzymes de restriction qui produisent des bouts cohésifs complémentaires (XbaI et NheI), puis je fais migrer sur gel (mais je colore avec du BET) puis je découpe mes bandes, purifie sur colonne en utilisant le même kit de purification que toi, puis je fais une ligation o/n à 16°C.  [...] J'ai également tenté d'insérer ma séquence codante dans un autre plasmide d'expression. là je digère mes deux plasmides (le vecteur vide et mon plasmide parental ) avec EcoRI et XbaI et j'ai testé les rapports 1.3 et 1.9. Lorsque je fais migrer mes produits de ligation, je ne vois plus mon vecteur vide mais des bandes qui pourraient correspondre à mon plasmide avec insert surenroulé et non surenroulé, ainsi que des concaténaires d'insert. Et là encore, je n'ai pas de colonie.  [...]

Correction devoir - Le monde microbien , biotechnologie, antibiotiques …

Il fait peut être référence au colonie blanc/bleu et au système d'induction à l'IPTG pour savoir si le fragment cloné est bien intégré dans le plasmide.  [...] LA chose la plus importante a faire pour eviter la resistance aux antibiotiques (loin devant les 3 citées) est de prescrire systematiquement une combinaison de au moins 2 antibiotiques (de famille differente). De cette maniere, tu n'auras pas l'apparition d'une resistance due a une mutation spontanée car la frequence d'une double mutation (equivalente a une resistance au 2 ATB) est bien trop faible.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Ensuite, as-tu fait des contrôles J'entends par là. as-tu électroporé ton plasmide tout seul que tu étales ensuite C'est un témoin indispensable Puis, as-tu pensé à étaler tes ligations sur des boîtes sans antibio Qui sait, peut-être qu'il y a un problème d'expression de la résistance et tu te retrouves avec des sensibles donc aucune colonie.  [...] Si tu n'as pas de colonies sur un milieu avec ampicilline, c'est que tes bactéries n'ont pas intégré de plasmide. As-tu fait des tranformations avec ces mêmes ligations mais avec d'autres bactéries hier Et ce que tu peux faire, c'est essayer de transformer d'autres cellules avec tes ligations.  [...]

[Biologie Moléculaire] Deux bandes en PCR

Tous les groupes ont les deux bandes sauf un Vous travaillez tous avec le même plasmide ou vous avez fait chacun une prep à partir d'une colonie bactérienne.  [...] Ceci dit la quantité de plasmide ne me semble pas etre la cause du soucis, vu que les trois premieres pistes ne contiennent que de l'ADNg si j'ai bien compris. Et la bande d'amplification est tres forte aussi.  [...]

Principe alpha complemetation PGEMT

Si le vecteur n'est pas circulaire il ne peut pas se repliquer il ne donnera donc aucune colonie. Tes colonies ont donc forcément un plasmide circulaire, soit il est blanc (pour les diverse raisons invoquées), soit il est bleu car par expl il n'est coupé a 100% (ce qui est peu probable dans le cas d'un plasmide acheté, mais frequent quand on le prepare soit meme).  [...] Bonsoir g une question. quel est le principe de alpha-complementation utiliser par les plasmides PUC et qui permet la sélection des clones recombinants grace a la lac-z Svp c urgent.  [...]