• Forum - Clones, Bactéries, Vecteur, Plasmide

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] Ton smear vient des bactéries je pense. Et ce que tu as dans tes puits c'est probablement ton plasmide avec l ADNg de tes bacteries.  [...]

[biologie moléculaire] Opéron lactose

Donc dans l'ordre, tu clones ton gène recombinant dans ton vecteur, tu transformes une cellule de E. coli avec ton vecteur, tu la fait pousser sur un milieu contenant un antibiotique, du X-gal et de l'IPTG. Si la colonie devient bleue, c'est que le vecteur se trouve dans la cellule, mais que le gène LacZ est intact, donc l'insertion du gène recombinant n'a pas fonctionné.  [...] ensuite lors de la sélection des clones recombinantes(les bacteries ayant incorporé un vecteur recombinant)on ajoute autre que l'antibiotiqe,de l'x-gal (incolore)qui vas etre cliver par le beta galogtosidase toute en produisant une coloration bleue,donc l'obtension de cette coloration indique qu'on est en présence des bacteries trasformeés par un plasmide intact.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Les 800 colonies obtenues sont bien celles qui ont le vecteur+insert n'est ce pas Quel marqueur utilises tu pour les différencier de celles qui ne possèdent que le vecteur sans l'insert Ex. lorsque l'insert contient LacZ (le gène codant pour la béta-galactosidase) une culture sur milieu contenant du Xgal permet de reconnaitre les bactéries qui ont l'insert car elles sont bleues.  [...] - plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle).  [...]

[Biologie Moléculaire] difficulté plasmide lentiviral

J'ai un problème de clonage d'un petit oligo (shRNA) dans un vecteur lentiviral qu'il faut digérer AgeI/EcoRI pour le site de clonage. Sauf que mon problème se révèle bien plus basique que cela, après quelques déboires, je viens de me rendre compte que je n'arrive même pas à obtenir des clones après transfo de mon plasmide simplement digéré EcoRI OU AgeI et religué sur lui-même.  [...] .. Le plasmide non digéré se transforme sans problème même si après une nuit à 37°C les clones sont assez petits. Pour info, il est conseillé d'utiliser des bactéries déficientes pour la recombinaison avec ce plasmide, donc j'ai utilisé des SURE2. Je précise aussi qu'après avoir constaté que j'avais un problème basique dans ma ligation, je l'ai refaite avec nouvelle ligase et nouveau tampon de ligase et.  [...]

[Biochimie] banque d'ADN

comment fait on une banque d'ADN à partir de phage alors que ceux ci lysent la bactérie pourtant n'est ce pas les bactéries recombinantes qui forment la banque.  [...] Le phage lambda sert de vecteur. Ils portent l'ADN recombinant, vont infectés les bactéries hôtes et se multiplier. Cela permet de constituer une banque de phages clonés.  [...]

Ogm

j'ai cru comprendre qu'ils étaient inséré dans une bacterie E.coli vecteur de clonage pour se multiplier mais est ce que c'est les plasmides qui sont clonés dans la bactérie ou bien est ce que c'est la bactérie qui se reproduit tout simplement (question sans doute bete mais bon ).  [...] En fait les plasmides existe en plusieurs exemplaires dans la bactérie (selon la taille du plasmide et sont utilité ça peut aller de quelques exemplaires a plusieurs dizaines) mais c est surtout par la multiplication des bactéries que le nombre de plasmides est augmenté ensuite on fait éclater les cultures bactériennes et on récupère les plasmides d intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse: Pb...

En fait en faisant d'autres mutations sur la même matrice d'ADN, on observe des clones bactériens. De même une PCR screen de ces mêmes clones montrent la présence du plasmide.  [...] Chez d'autres bactéries comme E. coli DH5 alpha, avec 10 ng de plasmide on a un nombre de colonie énorme sur boite. Donc faire preuve de retenue lorsque l'on n'est pas d'accord avec un protocole fonctionnant pour quelqu'un d'autre me parait judicieux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Banques d'ADNc

Les banques d'ADNc permettent de créer un image moléculaire de tous les ARNm exprimés dans un tissu ou à stade du développement donné. Par une série de manip, les ARNm seront sucessivement copiés en ADNc et insérés dans des vecteurs. Ces banques pourront être utilisés pour isoler les ADNc de génes particuliers qui seront identifiés selon les propriétés recherchés.  [...] Aprés, si tu veux utiliser les clones de ta banque pour un clonage, tu sélectionnes un virus de ta banque ( il existe plusieurs techniques dont celle de criblage de banque) pour faire une transduction sur tes bactéries. Ainsi tu amplifies ton vecteur et par la suite tu peux isoler les vecteurs amplifiés pour tes clonages.  [...]

[Biologie Moléculaire] aide sur le séquençage de l'ADN

Tu peux le cloner dans un vecteur à bouts francs tels que le pGemT-Easy puis envoyer à séquencer l'ADN plasmidique de quelques clones recombinants (vérifiés par PCR) accompagné d'une préparation d'un oligo qui s'hybride sur le vecteur. Le tout selon les conditions requises par le prestataire de services.  [...] Cloner puis séquencer est aussi préalable à l'expression du gène dans un système hétérologue... Du coup, on comprend le pourquoi du clonage avant le séquençage (encore faut-il qu'il s'agisse d'un vecteur d'expression si c'est vraiment là, le but de la manoeuvre).  [...]

Intégration dans un plasmide

Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.  [...] Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.  [...]