• Forum - Clonage, Sites, Promoteur

[Génétique] carte de restriction

j'ai un exercice dans lequel je dois faire la carte de restriction. or je n'arrive pas à comprendre comment faire car j'ai. région du promoteur du gène et la séquence du site de clonage multiple.  [...] Tu prends la séquence de clonage et tu cherches tous les sites dans ta séquence promoteur+ gene. Ensuite tu en déduis la taille de chaque fragment généré par restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Beta galactosidase chez Saccharomyces cerevisiae

Là même chose, j'ai réalisé ma construction de telle sorte à ce que mes fragments peptide promoteur, peptide signal et beta gal soient en phase, j'utilise pour celà des sites de restriction bien sûr, mais j'ai vérifier avant de faire mon clonage.  [...] Ce type de cellule n'existe pas, mais je pensais mettre ma construction sous dépendance d'un promoteur fort, juste pour voir si c'est exprimé ou pas...Par contre si ça ne l'est pas, je ne saurai plus trop quoi faire, car j'ai des publi où ce système fonctionne mais sous dépendance d'un autre promoteur faible le CYC 1 (promoteur du cytochrome chez la levure).  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

Le vecteur d'expression contient en plus de la séquence de résistance et du site de multi-clonage et du site d'origine, il contient en plus un promoteur.  [...] Une Enzymes de restriction est une endonucléases d'origine bactérienne capables de cliver l'ADN double brin en des sites spécifiques.  [...]

[Biotechnologie] Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

Ensuite, on a évidemment notre gène d'intérêt, son promoteur eucaryote, le signal de terminaison de la traduction, les sites de restriction (MCS) et le gène de sélection (auxotrophie le plus souvent ou résistance à un antibiotique). J'en suis à 7 (ou 6 si on compte les ORI pour 1).  [...] J'aurai mis un gène de sélection (un gène de résistance aux antibiotique ou un gène du métabolisme pr la levure) et un gène rapporteur, un promoteur, MCS (un site de clonage multiple). Tu peux mettre le + 1 avec la flèche juste après le promoteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

En fait, j'ai fait un clonage. j'ai essayé d'inserer un gène (2,5kb) dans un plasmide (10kb, pCambia 1300), en aval d'un promoteur (qui lui est déjà préalablement inséré dans le même plamide). Mais comme je travail sur un même site (SacI), j'ai réussi (après beaucoup de galère) à avoir une clone positive mais avec mon insert inversé (criblé par pcr et vérifié par digestion).  [...] En fait, je part du plasmide avec l'insert inversé puisque c'est la seule colonie positive que j'ai eu (Etant donné que je suis sur ce clonage depuis plus de 3 mois). Je religue directement après. Evidemment, j'ai eu beaucoup de background.  [...]

Clonage orienté

Je suis bloquée, j'ai un peu de mal avec les enzymes de restrictions et je comprend pas tout à fait ce que l'on me demande. Sachant que l'on veut un clonage orienté, on me demande de choisir les enzymes de restrictions utilisable du côté de la bordure portant la séquence du promoteur T7 sachant que le fragment d'intérêt contient un site SacII.  [...] Si c'est bien le cas, cela signifie que tu ne peux pas utiliser SacII pour le clonage. En effet, le clonage va consister à amplifier ton insert avec des oligos de PCR portant des sites de digestion aux enzyme de restriction voulues. On ne veut donc pas que la digestion en question coupe ton insert en deux.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ( multi cloning site ) entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image).  [...] Ici tu peux voir entre le promoteur et le terminateur ce MCS qui contient plein de sites de restriction. Il y a aussi l'origine de réplication (ColE1), un gène de résistance à la néomycine (neoR).  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN antisens à partir d'un fragment de gène

Ces phages ont des ARN polymérases très efficaces et des promoteurs très simples et petits. Ils vont permettre de fabriquer in vitro de l'ARN.  [...] Un plasmide vecteur de clonage créé artificiellement peut avoir autour de son MCS (Multiple Cloning Site) deux promoteurs différents (phages T7 et SP6), ce qui peut donner lieu à deux ARN (un sens et un antisens), selon que le démarrage de la transcription se fasse à un promoteur ou à l'autre.  [...]

régulation de l'expression de dam par dnaA

De plus, la protéine DnaA s'autoréprime. avant la réplication, elle est en concentration maximale. C'est ce qui permet l'initiation de la réplication, mais aussi le bloquage de l'expression du gène dnaA.   [...] Enfin, comme le gène dnaA est situé près de l'OriC, sa réplication se faire juste après l'initiation. Or son promoteur contient, lui aussi, des sites GATC. ils sont donc très rapidement hémiméthylés, ce qui rend le promoteur inactif. Il faut donc attendre que Dam méthyle le promoteur dnaA pour que la synthèse de DnaA recommence.  [...]

[Biochimie] Expression protéique

Je partage l'avis de sr. Il faudrait que tu séquences la construction. Tu n'es pas obligé de séquencer l'intégralité, tu peux juste choisir des primers de part et d'autre de ton insert, s'hybridant sur le vecteur, pour avoir la séquence des jonctions (c'est la zone la plus critique lors d'un clonage).  [...] Commence par vérifier si il n'y a pas un problème évident. clonage raté (vérifie la séquence), anticorps de mauvaise qualité, antibiotique oublié, etc.  [...]