• Forum - Clonage, Région, Plasmide, ADN

[Biochimie] Linker, enzyme de restriction and co

Un polylinker est une région d'un plasmide contenant plein de sites de restriction, souvent uniques. Ce sont ces divers sites qui sont reconnus par les enzymes respectives. Tu peux rencontrer aussi le terme MCS, pour Multiple Cloning Site (ou Site de Clonages Multiples).  [...] Beh même si tu mets 3L de ligase, tu n'auras pas de clonage Excepté le cas où une recombinaison peut se produire entre une région du plasmide et l'insert et à condition que l'ADN linéaire que représente ton insert ne soit pas détruit, tu pourras éventuellement avoir un truc recombinant.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR?

La mutagenèse permet d'obtenir un court segment de séquence comprenant la région mutée. Il faut ensuite remettre cette séquence dans le plasmide d'origine, à la place du petit segment non-muté. Le meilleur moyen de le faire c'est par simple clonage grâce à des enzymes de restriction.  [...] La mutagenèse permet d'obtenir un court segment de séquence comprenant la région mutée. Il faut ensuite remettre cette séquence dans le plasmide d'origine, à la place du segment non-muté. Le meilleur moyen de le faire c'est par simple clonage grâce à des enzymes de restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Manque de fiabilité crible Blanc-Bleu

Je suis en L1 Bio et doit faire un CR de TP sur un clonage de fragments d'ADN du phage Lambda par le plasmide pBluescript.  [...] Enfin il y a aussi des faux négatifs, c'est à dire des clones bleus qui peuvent contenir l'insert car cet insert n'empeche pas la synthèse de la b-gal.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

Ca fait deux semaines que je tente de faire une ligation entre pCLNCX et mon insert. J'ai coupé mon plasmide par HindIII et amplifié mon insert avec des amorces contenant le même site de restriction HindIII, la taille de mon insert est bonne. celle de mon plasmide aussi, il a bien été digéré car j'ai comparé le plasmide digéré ou non.  [...] Refait le clonage à partir de ton fragment sorti de PCRTopo mais sans déphosphorylé ton plasmide. La CIP ou la shkink abime parfois les extrémités de l'ADN rendant impossible toute ligation.  [...]

Technique ADN recombinant

1)Ce que je ne comprend pas c'est que une fois que l'adn à été intégré dans le site de clonage sur le plasmide il fait en sorte que la beta-galactosidase n'est pas produite par lacz du moins pas une beta-galactosidase fonctionnelle.  [...] 2) pour le puC19 qui contient un mcs (multiple cloning site) comment se fait-il que le mcs qui consiste donc en des séquences spécifique de nucléotides si j'ai bien compris ne perturbe pas la lacZ vu qu'il est en plein dans le gène si j'observe bien l'image suivante ( je joins l'image).   [...]

Augmenter la capacité d'1 plasmide??

Ben, c est un cosmide je pense, dans mon cours on me dis qu on peut augmenter la capacité d un plasmide en faisant d abord un clonage avec un ADN genomique puis...puis je comprends plus rien. c est pour augmenter la quantite d ADN a incorporer...plus on met des sites cos plus on peut y inserer des choses.  [...] .c est avec un phage lamba je pense...on dis qu on peut supprimer des choses pas interressante hors du cosmide formé, mais une fois qu on a des site de clonage et des sites cos, c est bon, non je vois pas trop de dif avec le clonage en fait.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

J'ajoute toujours un point sans ADN dans ma transfo pour vérifier que rien n'est contaminé par un plasmide ou une bactérie AmpiR. en 25 ans de clonage, ce témoin est sorti positif deux fois. Le risque est faible mais pas nul.  [...] Nous utilisons le SYBRsafe depuis 5 ans (on peut le voir sous un dispositif à lumière bleue qui peut être facilement bricolé, pas besoin d'acheter le transilluminateur hors de prix d'Invitrogen), nous avons mené des clonages en parallele pour comparer BEt vs SYBRsafe et il y a presque deux logs d'écart en efficacité de transfo entre un plasmide religué en présence de BEt et le même en présence de SYBRsafe.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...] ... Au final tu vas peut-être découvrir que le site de clonage multiple a été modifié pour je ne sais quelle raison et donc que ton clonage est voué à l'échec (situation déjà vue dans tous les labos ou presque). Ne vérifie pas la totalité du plasmide mais au moins la région correspondant à l'insert et SURTOUT les endroits où tu coupes.  [...]

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

prends ton plasmide et effectue des digestions avec une enzyme de restriction particulière (eco R1 par exemple) ensuite fait ton gel et fait migrer ton produit de digestions.  [...] Generalement les bacteries synthetise des enzymes de defence.ENZYMES DE RESTRICTION qui degrade tout ADN etranger.ces enzymes sont utilisé dans le clonage dans la coupure de l'adn plasmidique pour inséré un fragement d'adn.  [...]

apoptose

en plus, le clonage peut servir aux transformations aussi, quand on transforme les bactéries avec le plasmide portant l'ADN amplifié.  [...] je ne peux pas contacter mes prof car nous sommes en vacances, mais je vais vous répendre d'apres mes connaissances, le clonage necessite un vecteur donc culture et prend du temps, la PCR est plus rapide (se réalise dans un tube à essai) et le taux d'amplification est très élevé.  [...]