• Forum - Clonage, Expression, Levure

[Biochimie] clonage et expression de gènes chez la levure

voila comme je ne suis pas très fort en biologie moléculaire, je me demande pourquoi effectue-t-on le clonage et l'expression des gènes plutot chez la levure que la bactéire.  [...] Il semble de plus que les bactéries utilisent des acides aminés qui n'existent pas chez les eucaryotes (synthèse à partir d'un acide aminé lié à son ARNt), ce qui perturberait l'expression protéique d'un gène d'eucaryote.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

Pour ce qui est des proportions, c'est vraiment de la cuisine. Pour mon dernier clonage en date, j'ai essayé d'introduire un insert de 200pb environs dans un plasmide de 8000pb... Autant dire qu'en utilisant la formule mathématique classique pour le calcul j'obtenais des quantités d'insert à utiliser ultra faibles.  [...] En gros, moi je fais le sous clonage dans top 10 pour amplifier le plamside recombinat PICZ-P30 pour pouvoir aprés l'introduire dans la levure pichia pastoris et le faire exprimer en induisant l'expression par l'ajout du methanol ds le milieu de culture.  [...]

[Biotechnologie] Bloquer l'expression d'un gène chez la levure

j aurais voulu savoir si il existait chez la levure un moyen de bloquer spécifiquement l expression d un gène chez la levure mais de bloquer de façon temporaire donc pas de deletion. un peu comme les RNAi.  [...] j'ai pas une explication et meme pas une idée pour induire l'expression de ma proteine et la produie vers l'exterieu de la levure.  [...]

[Biologie Cellulaire] Pharmacologie moléculaire

C'est pour la production de protéines recombinantes. Un système d'expression correspond à l'organisme que tu utilises pour exprimer ta protéine (bactéries, levures, cellules d'insectes...). Lorsque tu produits une protéine dans l'organisme où elle est présente naturellement (par exemple si tu produits une protéine humaine dans des cellules humaines ou une protéine de coli dans E.  [...] coli ), on parle d'expression homologue. Mais si tu produits une protéine humaine dans une levure, ou une protéine de levure dans une bactérie par exemple, tu utilises alors un système d'expression hétérologue.  [...]

[Biotechnologie] Global Analysis of Protein Activities using proteome chips

The yeast expression strains contain individual plasmids in which the correct yeast ORFs have been shown to be fused in-frame to GST by DNA sequencing. The proteins were expressed in yeast to help ensure that the proteins were modified and folded properly.  [...] Ils purifient ensuite la protéine d'intérêt (grâce à la séquence GST). Sur les 1152 protéines différentes produites en même temps par cette méthode, ils en sélectionne aléatoirement 60 pour les tester par WB (afin de vérifier l'expression de la protéine d'intérêt).  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

J'ai trouvé plusieurs publications à propos, mais la manipulation a l'air compliqué, et j'ai un temps très restreint pour mes manipulations. Je ne veux pas me lancer dans quelque chose de compliqué, mes profs cherchent juste à évaluer mes compétences pratiques en matière de clonage et d'expression.  [...] Chez la levure, il y a un papier qui est sorti l'année dernière sur un système d'expression simple et efficace des protéines membranaires. Rapid expression screening of eukaryotic membrane proteins in Pichia pastoris.  [...]

Aide article : Système d'expression protéique hautement régulé, modulé et à haut niveau (PBAD)

Vectors Containing the Arabinose PBAD Promoter. Cette article démontre l'avantage d'utiliser un système arC -PBAD (d'un point de vue cinétique, efficacité et peu d'effet secondaire), cependant il date de 1995, j'aimerai savoir si actuellement il existe un système de régulation de l'expression protéique qui le surpasse.  [...] Je ne connais pas les taux d'expression que l'ont peut atteindre avec ce système, ça n'intéresse pas grand monde d'ailleurs. On se dirige plutôt vers une expression proche des niveaux endogènes que l'inverse ces derniers temps.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage moléculaire

bonjour à tous, lors d'un clonage moléculaire, avec pour cellule hôte, une levure (c.eucaryote), comment on procéde pour intégrer notre ADN insert dans cette levure...autrement reformulé. comment procéder pour transformer notre insert dans la levure.  [...] Tu ne mets pas comme ça ton insert ds la levure. Il faut passer par l'internmédiaire d'un vecteur par exemple un plasmide mais la nature du vecteur peut changer selon la taille de l'insert ou la nature de l'hôte récepteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sequence a ajouter avant un site de restriction

Je me lance dans le clonage d'un gène, que je vais amplifier a partir d'ADN génomique de levure (le gène ne contient pas d'intron).  [...] Il me semble qu'il est préférable d'ajouter quelques bases avant (dans le cas du 5') et après (pour le 3') les sites de restriction afin que l'enzyme puisse cliver les extrémités de l'amplicon.   [...]

[Biotechnologie] Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

J'ai supposé qu'on prennait un plasmide bactérien, comme souvent pour l'expression dans une levure. Je trouve qu'on a donc besoin de deux origines de réplication, une bactérienne et une eucaryote. D'où ma première question. quel est la fonction de chaque, pourquoi en a-t-on besoin de 2.  [...] Et sinon, on peut parfois trouver un intron dans certains vecteurs d'expression (entre le promoteur et le gène), je crois que ça augmente la capacité d'expression. Mais je ne crois pas que ce soit nécessaire.  [...]