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[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI

Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI.  [...] je voudrai connaitre quelles sont les protéines chez E.coli qu'on utilise pour pouvoir normaliser une protéine d'intérêt (comme l'actine chez les eucaryotes).  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot.  [...] Pourriez m'expliquer comment on fait pour normaliser une quantité de protéines lorsqu'on réalise un western blot, je sais qu'il faut utiliser des protéines comme la béta tubuline mais techniquement on fait comment.  [...]

[Biochimie] protéine permettant de normaliser un western blot

Je travaille actuellement à quantifier des protéines sur western blot et pour celà j'ai besoin d'une protéine me permettant de normaliser... J'ai utilisée l'actine (il y en a probablement la même quantité dans outes les cellules mais mes résultats me semblent un peu érronné je voudrais donc savoir si quelqu'un utilise un normalisateur d'equerre pour ce genre de manip.  [...] je détecte une protéine du cytosquelette plus particulièrement du sarcomère. la calpaine 3, et ce que je crains c'est la variabilité de cette actine en tant que normalisateur, je ne peux pas non plus utiliser comme toi erk total ça ne s'appliquerait pas à la calpaine 3, je vais tester labéta caténine et la desmine. Merci.  [...]

[Biologie Cellulaire] Southern Blot, Northern Blot et Western Blot

Le but est bien de vérifier la présence d'une protéine (dans le cas du western blot) et de la quantifier (pour être exact ce n'est pas une quantification absolue mais c'est une mesure qui va permettre de comparer la quantité de la dite protéine entre deux conditions expérimentales.  [...] Petit exemple concret. admettons que tu travailles sur la maladie de Steinert, c'est une maladie musculaire (mais peu importe). Tu découvres une mutation sur le gène DMPK chez les patients qui ont cette maladie. Une question intéressante est de savoir si la protéine DMPK est présente chez ces patients malgré la mutation Pour cela tu peux prendre des cellules de patients et de personnes saines et faire un western blot pour comparer la quantité de protéine DMPK dans ces deux conditions.  [...]

[Biologie Cellulaire] Extraction protéique pour western blot

Mais ca n'a absolument rien à voir avec l'automatisation. Si l'ensemencement des cellules est bien fait il n'y aura aucune différence en western point final. C'est la multiplication des étapes qui introduit des erreurs. Lorsque tu fais une manipe dans laquelle les cellules ne prolifèrent pas à la même vitesse, ou lorsque la quantité de protéine est rédibitoire car pouvant entrainer des saturation etc.  [...] Pour ce qui est des inhibiteurs de protéases, ça me paraît quand même assez indispensable. Sinon ta protéine a plus de chance d'être dégradée et tu multiplies les risques d'avoir plusieurs bandes correspondant à ta prot sur le western blot. L'EDTA que tu as dans ton tampon est un inhibiteur donc tu devrais le rajouter (1 mM voire plus si tu n'as que ça).  [...]

[Biologie Cellulaire] centrifugation différentielle, peroxisomes

Parce que j'ai fait un Tp où on doit repérer une proteine par immunofluorescence, sur les photos tirées du microscope à fluorescence non confocal, la proteine serait plutôt dans le cytoplasme, peut-être sous forme de vésicules parce que c'est pas très homogène.  [...] On casse les cellules et on fait des centrifugation différentielles, celle à 2000G sépare le culot C1 du surnageant S1. Par analyse avec le Western Blot, avec les Anti-corps dirigés contre ma proteine, on voit que la proteine recherchée est dans la fraction C1.  [...]

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN.   [...] Je dois faire un western blot de la protéine FAS à partir d'échantillons provenant des cellules HepG2. Quelqu'un aurait-il des références d'anticorps qui marchent bien.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...), la protéine recombinante.  [...] Alors effectivement sur mon western j'ai fait migrer un extrait membranaire de rein et en parallèle un extrait membranaire d'une lignée cellulaire exprimant de façon endogène ma protéine. Les bandes surnuméraires que j'observe dans la lignée sont également présentes dans le rein. C'est effectivement peut être du non spé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

J'ai quelque souci de production de la protéine, j'arrive en avoir mais à des quantités pas très élevée. Sauriez-vous combien il faut de proteine en fusion avec la GST sur les billes pour faire le test pull down.  [...] La quantité nécessaire dépend de plein de paramètres, dont le poids moléculaire de la protéine d'intérêt (plus son PM est petit, moins il y a en besoin, car plus il y a de mole/µg), la force d'intéraction avec le partenaire, du type de détection (western blot, autoradiographie).  [...]

[Biochimie] qPCR :

Sachant que je sais que cette proteine est exprimée dans l'organe d'où j'ai extrait l'ARN, et que mon ARN (et mon ADNc) est de bonne qualité, je ne comprends pas pourquoi au bout de la 3eme paire de primers designées j'arrive toujours pas a amplifier mon gene d'interet.  [...] Si tu as accès à ce type de matériel, il pourrait être intéressant d'essayer un western blot sur tes cellules (détection de la protéine) ou un northern blot (détection des ARN).  [...]