• Forum - Cellules, Plasmide, Contrôle

[Biologie Cellulaire] probleme de transfection

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu'on étudie et qui contrôle l'Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.  [...] Problème. une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m'aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j'ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c'est stupide. Mais quand on panique….  [...]

[Journal club] Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

Le contrôle avec le rétrovirus seul aurait permis de contrôler que le processus de transduction rétrovirale n'est pas lui-même responsable de la transformation et/ou de l'immortalisation des cellules saines.  [...] A priori si on séléctionne uniquement l'intégration et que l'on construit la lignée sur les cellules séléctionnées il y aura plusieurs sites d'intégration. La lignée est hétérogène. Si l'on fait une transformation controle avec un plasmide vide ou contenant un élément neutre, on devrait pouvoir discriminer les effets inserts dépendants des effets vecteur dépendants.  [...]

[Biologie Cellulaire] CSM et pcdan 3

Je commence un nouveau stage depuis peu et le labo travaille sur des cellules souches mésenchymateuses. Une manip consiste à les transfecter stablement avec le plasmide pcdna3 ou pcdna3.1 afin d'exprimer stablement une protéine (donc sous contrôle du promoteur fort CMV).  [...] Est ce que quelqu'un a déjà eu ce type de soucis avec ce plasmide, voir en combinaison avec ce type de cellule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

La premiere est de verifier que tes cellules sont competantes (transformation d'un plasmide circulaire connus ~ 50 ng, genre pUC, pBR, etc).  [...] Normalement dans le kit tu devrais avoir un plasmide controle a transformer. Il faut vraiment que tu verifies tes cellules, ca arrive tres souvent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Projet de clonage

comme controle de lexpression in vitro (dans 3T3 cellules) il faut construire le suivant. clonez le gfp gen dans le plasmide pcDNA3.1 apres le CMV promoteur. c est un promoteur virale qui est actif dans toutes les cellules eukaryotes. controlez avec les enzymes de restrictions le nouveau plasmide. pcDNA3.1-GFP.  [...] on a aujourdhui parle de la strategie, pour les enzymes jai choisi le KpnIet BamHI. est ce qu il est necessaire de faire l isolation du plasmide de pcDNA3.1 au premier pour obtenir les plasmides.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Sinon le sens du contrôle négatif (je ne suis pas certain que cela ait été dit clairement) est d'évaluer indirectement la qualité de la coupure du plasmide. Si après vos restrictions il vous reste du plasmide non coupé, il va transformer. Ce qui est intéressant dans ce contrôle c'est de le comparer à votre boite expérimentale.  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

L'avantage par rapport au produit PCR est que la on peut controler la digestion (passage du circulaire au lineaire) chose pas possible avec le produit PCR, donc jusque la j ai cloner avec l'INSERT issue de la double digestion à patir du plasmide,la derniére fois le dosage de cet insert purifié est de 10.2ng/ul.  [...] Je vais suivre vos conseils et faire la transfo a 30seconces mais j sais pas si 2 min à 42°C tue vraiment les bactéries car le controle compétence (cellules compétente plus 1 ul de plasmide sauvage) est impeccable.  [...]

proteine ou cellule stable ???

i) transfecter avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt, puis effectuer sa manip sur les cellules (dans ce cas, toutes les cellules n'exprimeront pas la protéine, et celles qui le font, élimineront en quelques génération le plasmide).  [...] ii) transfecter stablement avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt et un gène de résistance, on ajoute un agent de sélection, donc seuls les cellules qui possèdent le plasmide survivent, et au final, il y aurait intégration du plasmide dans le génome.  [...]

Plasmide

J'ai préparé des plasmides que j'ai inséré dans des cellules d'E.coli compétentes et ensuite je les extrait avec le kit Wizard Plus SV pour analyser le plasmide qui a été introduit dans les cellules(je ne comprends pas l'interet car normalement je sais ce que j'ai introduit alors pourquoi je les extrait).  [...] La selection des plasmides recircularisés se fait lors de la transformation de cellules électrocompétentes. Seules les cellules ayant reçu un plasmide recircularisé pourront croitre sur le milieu sélectif car seulement ces plasmides peuvent coder pour le gène de résistance en question (la sélection doit se faire sur Ampicilline je suppose ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un plasmide à partir de cellules mammifères??

Essayes de faire une miniprep sur tes cellules, comme on le fait pour les bactéries. Le problème est que les tampons risquent de ne pas être adapté pour cette situation et rien donner comme production. Je ne vois que cette solution en tout cas car les extractions d'ADN classique ne séparerons pas le plasmide de l'ADN génomique alors que les kit mini-, midi- et maxiprep le permettent...pour les bactéries.  [...] Merci des conseils je ne sais pas si je vais le faire tout de suite mais si j'essaie je vous tiendrai au courant. En fait mon idée serait de faire une sorte de criblage car en gros je complémente un phénotype de blocage du cycle en transfèctant certains micro-ARNs et je me dis qu'en transfectant un pool de micro-ARNs (exprimés via ce plasmide) je pourrai récupérer les clones qui poussent et alors regarder quel(s) micro-ARN(s) a favorisé la prolif.  [...]