• Forum - Cellules, Phase, Marquage, ADN

Cycle cellulaire et cytofluorimétrie

ainsi en lisant de gauche a droite, les cellules en phase G1 ont un marquage de leur ADN moins fort que les cellules en pahse S qui elle-meme ont un marquage moins fort que les cellules en G2.  [...] via leur quantité d'ADN (2n, 4n et état intermédiaire) on est capable de connaitre la proportion de cellules a chaque phase du cycle (G1, S, G2,...) et c'est déjà pas mal je trouve, non.  [...]

[Biologie Cellulaire] Cycle cellulaire

ce double marquage va etre detecté par l'ordinateur qui va donner un histogramme. quelle est l'allure de cet histogramme et comment ce fait le tri dans ce cas est ce que en fonction des phases cad on obtient des cellules separées en fonction des phases du cycle.  [...] Pour le marquage à l'iodure de propidium, dans le cas d'une étude du cycle cellulaire, on fait une fixation dans l'éthanol à 70% ce qui fait office de perméabilisation pour la pénétration de l'iodure de propidium dans la cellule. Dans le cas d'une étude de l'apoptose avec co-marquage à l'annexin V, on ne fai pas cette fixation à l'éthanol, on met directement les cellules en présence d'iodure de propidium, de RNase A (pour augmenter la proportion d'iodure de propidium se fixant à l'ADN) et l'Annexin V.  [...]

[Immunologie] Méthanol et marquage extracellulaire

j'essaye de faire un marquage intracellulaire de phospho Stat5sur des cellules T (souris). Le protocole implique le marquage extracellulaire classique (marqueur CD4, CD25), la phase de fixation puis perméabilisation utilisant PFA et méthanol.  [...] Mais en utilisant le méthanol, je perds tous mes marquages extracellulaires.  [...]

[Biotechnologie] cytométrie de flux

Si mes souvenirs sont bons, on utilise bien la cytométrie pour caractériser les cellules en train de mourir. En général, on distingue les cellules en apoptose de celle en nécrose (deux types de morts cellulaires différents). Pour l'apoptose, on fait des marquages à l'annexin V (se fixe sur des phosphatidylsérine de la membrane plasmique).  [...] Pour les cellules en apoptose, il y a une étape de découpage de l'adn (peut etre pas pour l'apoptose caspase indépendante car il y a des sous vtype dans l'apoptose pour l'autophagie, je sais plus si on passe par des caspases) ce qui fait que le marquage à l'iodure de propidium est moins fort que pour des cellules en G0G1 (on parle de pré G1).  [...]

[Biochimie] Analyse cycle celluaire cytometrie de flux sur l'automate cyan

Bonjour à tous et à toutes, je suis nouvelle sur ce forum et j'espère que je trouverais des âmes bien veillantes pour m'aider avec ce petit soucis.   [...] J'ai réalisé lors de mon stage plusiurs manipulations de marquage avec Ac fluorescent pour la technique de cytométrie de flux.Seulement j'ai également effectué à la fin de mon stage un cycle cellulaire sur des cellules en utilisant comme intercalant ADN le vybrant violet.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marqueur spéficique apoptose

Le marquage Annexin V en FACS cible l'apotpose. Le problème est qu'après l'apoptose il y a ce qu'on appelle la nécrose post-apoptotique, mais qui se différencie tout de même de la nécrose simple qui elle n'est pas marquée par l'annexin V. On fait toujours un double marquage Annexin V / PI (iodure de propidium), ainsi on peut discriminer 3 types de cellules.  [...] Ben justement, c'est pour ça qu'on fait un double marquage. L'annexine-5 va marquer plus ou moins toutes les cellules mortes, et le deuxième marquage à l'iodure de propidium ne va marquer que les cellules en nécrose. Vu que l'IP est un intercalaire, il ne pourra marquer que les nécrosées, puisque l'ADN des cellules apoptotiques est dégradé.  [...]

marquage prolifération cellulaire

Dans une expérience ou l'on mesure la prolifération cellulaire, on utilise 2 marquages (un marquage par la ph3 et un au Brdu), puis on quantifie les cellules positives à la ph3 seulement.  [...] En effet, la ph3 marque les cellules mitotiques et le Brdu s'incorpore dans les cellules en phase S mais au final ils marquent tous deux la prolifération... L'utilisation d'un 2ème marquage serait peut-être pour vérifier le 1er.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunofluorescence et cycle cellulaire

Je souhaite identifier dans quelle phase du cycle cellulaire ma protéine est exprimée en immunofluorescence par co-marquage. Pourriez-vous m'indiquer des marqueurs qui fonctionnent très bien pour différentier les différentes phase du cycle.  [...] Oui je pense que c'est une bonne idée,car la protéine CENP-F commence à s'accumuler dans la matrice nucléaire durant la phase S, atteignant une expression maximale durant la phase G2. Au début de la mitose, CENP-F se concentre sur les kinétochores où elle persiste jusqu'en métaphase.  [...]

[Biologie Cellulaire] Apoptose et le gène Bax

Le top pour commencer à définir s'il y a apoptose ou pas c'est un marquage Annexin V/ PI des cellules et analyse en cytométrie de flux. Je ne connais pas les moyens dont disposes ton labo ni si cela fait partie d'un projet de recherche mais je commencerais par là (enfin pas vraiment, il faudrait déjà commencer par regarder la mort cellulaire globale en bleu trypan et/ou marquage PI en cycle cellulaire).  [...] Ce que tu peux faire qui est peu coûteux mais d'une efficacité toute relative, c'est un marquage de l'ADN de tes cellules au DAPI et visualiser au microscope à fluorescence la présence de noyaux condensés/fragmentés. Beaucoup d'autres moyens sont possibles mais pour rester assez général, c'est ce que je vois en premier.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage à l'iodure de propidium pour suivi du cycle cellulaire

- J'ai déjà fait un test avec la drogue qui m'intéresse, sachant qu'à la dose max que j'utilise, à t=24h, en TMRM j'ai 100% d'apoptose, mais en PI j'ai 30% uniquement. Je me doute bien qu'on doit observer moins de cellules apoptotiques dans le cas du marquage au PI (même si je ne sais pas trop pourquoi), mais de là à avoir une si grande différence, je pense que mon protocole n'est pas au point.  [...] Pour le marquage IP, comme tu l'as dit, les cellules en subG1 le sont surtout à cause d'une fuite des fragments d'ADN clivés hors de la cellule. Seulement, le clivage régulier de l'ADN internucléosomal est typique d'un processus apoptotique. Dans le cas des autres morts cellulaires, la dégradation de l'ADN peut intervenir plus tardivement dans le cas d'une mort cellulaire par autophagie et/ou est plus anarchique comme dans le cas d'une nécrose.  [...]