• Forum - Cellules, Culture, Puits

[Biologie Cellulaire] lame de malassez

Si tu as 30000 cellules par puits et que chaque puits fait 1 ml, pour une plaque de 6 puits, tu auras bien 30000*6= 180000 cellules au total pour ta culture.  [...] En fait au départ j'ai une plaque de culture à 6puits et 2mL de milieu de culture par puit avec 30000 cellules par puit ca c'est mon énoncé je suis d'accord avec toi ca fait vraiment pas beaucoup de cellules c'est ca qui m'embrouille un peu l'esprit et de la mon prof trouve d'après malassez qu'il y a 4*10exp6 cellules dans 6mL je ne vois pas dutout d'où ca vient.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage

Bonjour, SVP je voudrais savoir comment on appel le fait de mettre des cellules eucaryote dans une boite de pétrie a une concentration assez faible (100cellules par ml) afin d'obtenir des colonies individualisées et les mettre en culture par la suite dans des puits de sorte a retrouvé une colonie par puits dans une boite de 24 puits par exemple.  [...]

[Biologie Moléculaire] transfection lipofectamine LTX and PLUS reagent invitrogene

Pour 100µL de milieu de transfection (ADN-lipo-Plus reagent dans de l'opti-MEM), je te conseille d'ensemencer tes cellules la veille dans 1mL de milieu (si tu cultives en plaques 24 puits, à adapter sinon) de manière à ce qu'elles soient à H80% de confluence le lendemain, puis le lendemain pendant l'incubation de tes complexes, de laver ton puits avec du PBS, de remettre 400µL de milieu de culture sans serum puis d'y rajouter tes 100µL de milieu de transfection (limiter le volume pendant la transfection permet de réduire le temps que mettront les liposomes pour sédimenter).  [...] Je n'ai pas beaucoup de recul sur la culture des cellules en Opti-MEM. Je n'utilise ce milieu que pour la phase de transfection proprement dite, par la suite je remets toujours le milieu de culture classique.  [...]

[Immunologie] le test MTS :sos:

Dans l'article d'immunologie que j'ai lu, les auteurs utilisent le test colorimétrique MTS pour mesurer la production d'IL4, sur des cellules CT.4S. Au départ on a des cellules de rate B6 dans les puits, avec ou sans OVA (Ag soluble). Pour réaliser ce test MTS, ils ont du prélever du milieu de culture alors non.  [...] De plus j'ai lu que le MTS est un composé qui est bioréduit par les cellules en un produit coloré. le formazan qui est soluble et dont on peut mesurer la quantité en mesurant l'absorbance à 490nm. et que cette quantité est proportionnelle au nombre de cellules vivantes en culture.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème culture cellulaire HEK293 en plaque 96 puits

Je travaille actuellement avec des HEK293 que j'ai repiquées en plaque 96 puits dans le but de faire un MTS. 24h après le repiquage (~10000 cellules/puits), mes cellules apparaissent adhérentes, belles et bien éparpillées dans le puits mais peu confluentes (20% grand max).  [...] On dirait que mes cellules se sont décrochées lors du changement de milieu pour s'agglomérer sur les bords... J'avoue que j'ai du mal à comprendre surtout que j'ai été assez délicat pour éviter de décrocher les cellules (tips au fond du puits, coincé sur le bord, et aspiration du milieu doucement à la pipette puis dépôt du nouveau milieu en plaçant le tip sur la face interne du puits).  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage immuno fluorescent

Bonjour tout le monde, mon problème est le suivant. je souhaiterais cultiver mes cellules sur lames de verre en plaque 24 puits mais je n'arrive pas a trouver des lames de verres rondes de diamètre inférieur à 1.5 cm. En j'ai cherché pourtant. Si vous cultivé sur lames de verre pour faire vos marquages en immunofluorescence pourriez vous m'indiquer le fournisseur des lames de culture Merci par avance.  [...] Attention. toutes les cellules n'adhèrent pas sur du verre et il faut souvent faire un coating.  [...]

Comment gérer cette situation en stage?

Bon après je commence le stage, c'était le 5 janvier. Le premier jour était assez intéressant, j'ai redécouvert comment faire un elisa, avec un kit contenant les anticorps que je devais diluer, les mettre à adsorber sur les puits, j'ai aussi fait de la culture cellulaire (un passage de cellules classiques) et ma responsable m'a aussi montré comment filtrer du BSA pour faire un tampon pour de la chromatographie.  [...] Bon bien sûr ça s'arrête pas là, à 16h30 quand j'ai presque terminé ma manip, ma chef vient me chercher en me disant qu'elle a une réunion importante (qu'elle avait prévue depuis 2 semaines apparemment.) et que je devais aller la voir en salle de réunion pour qu'elle m'explique rapidement comment faire une deuxième manip sur les mêmes cellules, une manip que je ne connaissais pas et qu'elle m'a expliquée en 8 minutes chrono, de quoi paniquer un peu vu toutes les choses que j'essayais de comprendre alors qu'elle continuait à parler très très vite.  [...]

Culture cellulaire en 96 puits

Non, ce qui m'inquiete le plus, ce sont les comptages au Bleu de Trypan. je mets 30 microlitres de trypsine par puits, puis autant de milieu de culture lorsque les cellules se sont decollees. Mais alors je suis trop diluee pour faire un comptage correct. J'ai fait une tentative de centrifugation pour concentrer les cellules, mais dans de si petits volumes, je me demande si cela est bien raisonnable.  [...] J'ai déjà eu l'occasion de faire de la culture cellulaire, certes pas sur d'aussi petits volumes, mais chaque fois que je devais faire des comptages, je concentrais la trypsine pour n'avoir aucun souci en suite au niveau de la dilution du milieu cellulaire.  [...]

Comptage de cellules dans des puits

Notre enseignant nous a expliqué brièvement que pour connaitre le nombre total de cellules bleu dans notre puits, il suffisait de prendre quatre parties du puits ayant à peu près la même confluence, compter le nombre de cellules bleu dans chacune de ces quatre parties et d'en faire une moyenne.  [...] En effet, pour moi, il faudrait que pour les quatre régions choisi du puits on compte les cellules coloré en bleu et celles non bleu pour pouvoir faire un proportion sur l'ensemble du puits permettant de trouver le nombre de cellules colorer sur les 3000.  [...]

[Biologie Cellulaire] MTT et Cristal violet

J'ai eu la semaine passée mon premier TP de culture cellulaire et j'ai du colorer 2 plaques a 96 puits avec 2 méthodes de comptage différentes, MTT et Cristal violet.  [...] Quels mécanismes sont à l'origine de la coloration Interactions du colorant avec un élément précis de la cellule, métabolisation du composé en dérivé coloré, etc... Du coup, il peut y avoir dans certains cas un marquage de toutes les cellules, et dans d'autres cas un marquage uniquement dans les cellules métaboliquement actives Quel temps de manip pour chaque Depuis la préparation jusqu'à la lecture y'a t'il une technique plus longue que l'autre La lecture en question, comment se fait-elle.  [...]