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[Biologie Moléculaire] le rôle de CaCl2 !!

on sais tous que le rôle de CaCl2 dans le colonage est de rendre la cellule hôte du plasmide compétente pour la préparer au choc thermique.  [...] s'il vous plait, je veux savoir le mécanisme qui permet au Chlorure de Calcium de rendre la paroi de la cellule hôte fragile.  [...]

besoin d info sur la transfo des levure au PEG

L acetate de Lithium agit en permeabilisant la menbrane afin de faciliter l entree du plasmide. Le plasmide est melangé avec un ADN entraineur (carrier) qui facilite egalement l entree du plasmide. Les Peg par sa viscosite garde les cellules encontact avec l adn et facilite l adsorption.  [...] Le choc thermique entraine l entree du plawsmide dans la cellule. Certains marqueurs de selction sur les plasmides necessitent un temps de recuperation avant de les etaler sur milieux selectifs. Voila j espere que ca a pu t aider.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transformation au CaCl2

Bonjour, j'ai deux petites questions a propos de deux étapes de la transformation cellulaire au CaCl2. 1- Quel est l'utilité du choc thermique après l'ajout du CaCl2 Moi je crois que cette étape sert a insérer le vecteur dans la cellule. 2- pourquoi préchauffer le milieu SOC avant étalement sur gélose Quel sont les avantages et les composantes au milieux SOC Merci.  [...] Pour faire de la transfection, il faut faire entrer un gros truc dans une cellule, protégée par une membrane plasmique imperméable. Un choc thermique (ou électrique) induit un stress important qui fragilise la membrane, et facilite l'entrée de l'ADN. Ca tue pas mal de cellules, mais la transfection est un compromis qui permet au final de garder quand même des cellules vivantes ET qui ont recu de l'ADN.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

Le protocole est assez classique. transformation de bactéries avec 5ng de plasmide par choc thermique et sélection sur pétrie avec d'ampicilline.  [...] Ce qui est étrange est que cette technique est censée être au point. Avec les conditions indiqué le plasmide codant pour la GST seul devrait déjà nous donner une bande bien visible après marquage au bleu de coomassie sur gel de poly-acrylamide. Autrement on a déjà essayé de doubler la concentration d'IPTG (et aussi essayé l'IPTG d'un autre labo).  [...]

principe de transformation des levures?

Si c'est ça le principe est pas trop compliqué,tu introduit un plasmide bactérien modifier compartant le géne que tu veux introduir dans ta cellule qui aurra préalablement était rendu perméable grace à un tampon ( enfin je crois que c un tampon. non).  [...] le principe est tres simple le PEG et le LiAc perméabilisent la membrane de le levure, ensuite grace a un choc thermique l'ADN pénettre dans la cellule.  [...]

Surexpression d'un gène

par exemple si on prend le cas des protéines heatshock qui sont des protéines de réponse a un choc thermique, il y en aura des quantité très mince en temps normal, mais au moment d'une chaleur intense, la cellule va se mettre a synthétiser bien plus de cette protéine qu'elle n'en produit en temps normal, car (sans rentrer dans les détails, et en te vulgarisant le principe au maximum,) certaines molécules on senti le choc thermique et ont dit qu'il fallait que les ARN polymerases (les enzymes qui vont faire s'exprimer les gènes pour pouvoir avoir des protéines) se fixent sur le gène de protection au stress thermique et qu'elles en fabriquent beaucoup d'ARNm.  [...] Autre mécanisme. la duplication (ou triplication, etc) du gène qui code la protéine en question. Du coup plus de transcrits et plus de protéine. C'est l'un des mécanismes par lesquels les moustiques deviennent résistants à certains insecticides.   [...]

[Microbiologie] Résistance des bactéries à l'acidité

J'imagine que non, du fait qu'il n'y a pas de plasmide de résistance à l'acidité. et c'est tout le fonctionnement de la cellule qui doit être compromis.  [...] Pour la reponse au choc thermique, c'est pareil. La cellule va declencher une reponse gouvernee par le facteur sigma32. Ce facteur sigma va specifiquement diriger la transcription vers des genes impliques dans la survie a haute temperature (chaperonne etc...).  [...]

Des OGM maison ?

la deuxieme méthode necessitera un peu plus de matériel et connaissance, mais au final, c'est plus ou moins juste un choc electrique sur des bactéries en solution avec le plasmide à insérer.  [...] Et je passe sur l'obtention du plasmide et la ligation de ton gène (après PCR) dans le plasmide (ce qui necessitera d'autres enzymes... chères), avant de pouvoir effectuer l'electroporation ou le traitement CaCl/choc thermique.  [...]

[Biochimie] Problème de transformation

en suite pour la transfo i let possible que toute mes cellule soit morte pendant le choc thermique en effet peu etre devrai je attendre 45s au lieu de 90s.  [...] Je ne pense franchement pas que ca ait la moindre influence. le choc thermique est important. si tu diminues la vitesse, tes bactéries n'auront même pas le temps d'être transformées.. et 42°C, pour E. coli, ca n'est pas optimal, mais c'est pas non plus comme si tu les laissais une heure à 60°C, ca ne va certainement pas les tuer.  [...]

Clonage

Tu obtient alors une cellule oeuf haploïde (qui n'a qu'un seul exemplaire de chaque chromosome). Tu bloque ensuite la première division cellulaire (par un choc thermique par exemple), donc l'ADN s'est répliqué, mais la cellule ne s'est pas divisée, tu as donc une cellule diploïde dont les chromosome homologues sont strictement identiques (ce qui n'est pas le cas chez papa végétal d'ou vient le pollen puisque lui avait bien un chromosome qui venait de son père, et un qui venait de sa mère ).  [...] j'ai purifiée une enzyme à partir d'un extrait de cellule animale dont le génome n'est pas séquencé et je voudrais cloner cette enzyme. Est ce que vous pouvez m'aider concernant la procédure à suivre merci d'avance.  [...]