• Forum - But, Colonies, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Question Urgente Sur Le Clonage

J'ai une question. ont a une boite pétrie avec 5 colonie bactérienne ( meme souche meme espèces.. ) c es les meme bactéries a l exception d une seul ca particularité c'es que elle porte une gene que ont lui a implémenter.  [...] le but est de trouver des colonies positives le gène est dans un plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Sinon pour identifier les plasmides ayant un inser, pourquoi ne pas faire un crible de PCR sur colonies avec un oligo specifique de l'insert et un autre du plasmide ca marche tres bien et on est certain de la presence de l'insert (car la disparition d'une resistance par inactivation d'un gene peut aussi etre du a une mauvaise religation du plasmide sur lui meme.).  [...] Sinon pour identifier les plasmides ayant un inser, pourquoi ne pas faire un crible de PCR sur colonies avec un oligo specifique de l'insert et un autre du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

T1 est un contrôle qui permet de voir combien tu obtiens de clones avec ta simple digestion de plasmides. Si tu as des colonies c'est que tu as encore des plasmides qui n'ont pas été digérés pendant cette étape.  [...] T2 permet de voir l'efficacité de la ligation. Tu vas recirculariser tous les plasmides digérés et donc sur ta boîte tu auras plus de colonies que dans T1.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

J'ai alors redigéré les plasmides venant de cette clone et refaire la ligation. Sur 40 colonies, j'ai eu 6 qui ont mon insert dans le bon sens (d'après le pcr) sauf que si je fait le miniprep à partir de ces colonies je me retrouve finalement avec des plasmides vides (c'est à dire sans mon insert).  [...] Je refait le manip (dépuis le pcr des colonies positifs, avec comme controle le plasmide vide) pour confirmer que je me suis pas trompé de colonies mais ça donne toujours la même chose. Donc je commence à penser que les bactéries rejettes mon insert et seulement quand celui-ci est dans le sens que je veux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

1/ Calcule to efficacité de transformation, si elle est en dessous de 10^6 colonies /ug de pUC18 (ou un plasmide de petite taille équivalent), jette tes bactéries et reprépares-en d'autres (ou achètes-en d'autres). Je vois trop d'étudiants me dire j'ai transformé 1ug de plasmide et j'ai un tapis, donc mes bactos sont OK.  [...] Des bactéries à 10^4 colonies/ug donneraient aussi un tapis avec 1ug de plasmide, pourtant elles seraient impropre à la plupart des constructions.  [...]

[Génétique] vecteur de plasmide

- des colonies blanches ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide et l'insert puisque l'insert se retrouve en plein milieu du gène lacZ, il est non fonctionnel donc pas de synthèse de B galactosidase et donc pas d'interaction avec le substrat chromogène (X-gal).  [...] - les colonies qui n'ont pas intégré le plasmide sont éliminées par l'antibiotique contenu dans le milieu car elle n'ont pas le gène de résistance.  [...]

[Biotechnologie] An efficient TALEN mutagenesis system in rice

L'ADN chromosomique (hors plasmides, etc.) provenants des individus/plants résistants à l'hygromycine est extrait avec une méthode/kit rapide spécifique pour plantes (ex. Tiangen TM concernant l'équipe qui publie). La même méthode de digestion par PCR / enzymes de restriction que pour les chloroplastes est appliquée pour scanner les lignées transgéniques (Fig.  [...] 4. Miniprep the plasmids and confirm the correct colonies by repeating the restriction enzyme digestion, but the digestion time can be shortened to 510 min.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse: Pb...

C'est bien joli d'avoir des idées fixes sur les protocoles mais selon le matériel à disposition, chaque protocole nécessite des optimisations qui vont l'adapter au matériel. Pour mes transformations chez E. coli BL21(DE3) il me fallait 100 ng de plasmide issu de la ligation pour avoir un nombre de colonies transformées correct.  [...] Après transfo on étale sur LBA pour pouvoir selectionner les colonies qui expriment le plasmide muté. Et non je n'obtiens aucune culture.  [...]

mode de resistance aux antibiotiques

L'existence des plasmides et leur rôle dans l'échange de gènes est non seulement démontrée, mais en plus ce fait est utilisé avec succès dans la réalisation de bactéries OGM. En effet les plasmides sont un des trois moyens en biotechnologies pour transformer une bactérie.  [...] celles qui ont incorporé le plasmide peuvent se développer et former des colonies. Et hop, on est certain à 100% que les bactéries qu'on prélève ont le plasmide en elles.  [...]