• Forum - Bruit, Contamination, ADN

qPCR résultats hors gamme standard!!!

Cette valeur de Ct me fait penser à une légère contamination par de l'ADN génomique. Comme ton ARN-cible n'est pas présent, tu vois l'amplification de l'ADN génomique résiduel de ta prep.  [...] 3) Je réitère ma proposition d'estimer la quantité d'ADN génomique contaminant par un couple d'amorce situé dans un intron. C'est un contrôle de contamination et de niveau de bruit de fond imparable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Le problème c'est pour la suite, on doit rendre un résultat scientifique (j'ai déjà calculé le % de contamination et je suppose que je doit utiliser les données fournies mais à part la concentration en ADN total, je ne vois pas ce que je dois faire des autres ) et un autre que même l'agriculteur producteur des échantillons est capable de comprendre (importance des dégâts, traitement possible si oui lequel...).  [...] Par contre l'un de ces 3 témoins présente un Ct très important (donc très peu d'ADN présent mais pas 0) est ce une contamination (et donc je ne peut pas valider le reste de la manip) ou est ce seulement une sorte de bruit de fond.  [...]

[biologie moléculaire] qualité d'ARN

pour l'extraction d'ARN, le pH de ton phénol chlo doit etre 4.7 (saturation au citrate). Ensuite le ratio 260/230, qui doit être strictemnt supérieur à 2 reflète les contaminations en sels et alcools. Le phénol abborbe plutot à 270 (noyau aromatique).  [...] Sinon j'ai refait un gel d'ARN en déposant 500 ng au lieu de 1µg et en dénaturant 5 min à 68°C. le résultat est moins beau et je n'ai pas diminué le bruit de fond excepté les smears c'est à dire une contamination d'ADN génomique potentielle.  [...]

Hybridation in situ

J'ai une question concernant l'hybridation in situ et je ne trouve pas de réponse. Voilà. dans mon protocole, je fais une préhybridation avec un tampon contenant de l'ADN de sperme de saumon, du formamide désionisé et du SSC 20X. Je sais que cette préhybridation permet de réduire le bruit de fond mais j'aimerai savoir comment ça fonctionne exactement, quel est le rôle de chaque produits utilisé.  [...] Donc tu déplace le bruit de fond vers l'ADN de saumon. Et comme tu vas éliminer cet ADN tu diminues le bruit de fond de ta préparation. L'interet de l'ADN de saumon est de diminuer le signal nucléaire de tes préparation (hybridation ADN/ARN). Ca reste très théorique et dans la pratique je ne le fais pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert.  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.   [...]

[Génétique] Inconvénient de la PCR

Dans tous les cas, on ne sait pas d'où elle vient, et s'il y a contamination, l'expérience n'est pas interprétable et il faut recommencer.  [...] Les contaminations arrivent vite, car une très petite quantité va être amplifiée en même temps que le fragment d'ADN d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

2. D'où 2ème problème. il peut arriver que l'efficacité de la PCR soit différente entre la PCR sur la gamme standard et la PCR sur l'échantillon. Notamment si les conditions/méthodes d'extraction d'ADN sont différentes, tu peux avoir des contaminants différents qui vont influer différement sur l'efficacité de PCR, et donc l'utilisation de la gamme standard sera un peu faussée.  [...] La Q PCR c'est établir une gamme étalon d'un ADN controle ( Quantité d'ADN au départ connu) généralement un plasmide avec 1000, 10 000 100 000 et enfin 1 000 000 copies et définir pour chaque quantitées le nombre de cycle néssaires pour avoir un signal différent du bruit de fond (le cT) celui-ci est donc inversement proportionnelle à la quantitée d'ADN du départ.  [...]

[Biologie Moléculaire] bandes après electrophorèse

Je comprends pas bien la question. Si c'est un contrôle négatif et que tu as une bande, ça veut dire que ton mix de PCR est contaminé. Si c'est un contrôle positif, alors pas de soucis.  [...] Parce que la coloration de tes échantillons se fait proportionnellement à la quantité d'ADN, du coup ta cible, présente à des milliers d'exemplaires, est très colorée, et les autres fragments sont si peu nombreux qu'ils sont invisibles et donc confondus dans le bruit de fond.  [...]

Gene récessif, dominant, codant ou non

Pour certains auteurs, ADN codant comprends aussi l'ADN qui code pour des ARNs non traduits en protéines (ARNt, les ARNs dits non codants. siRNA, miRNA, piRNA, les longs ARNs non codants,...), par opposition à l'ADN qui n'est pas du tout transcrit. centromères, séquences régulatrices de type enhancer/silencer (qui peuvent réguler un gène alors qu'il sont à des kb en amont ou en aval...).  [...] Et encore, parler d'ADN pas du tout transcrit est abusif selon certains, qui décrivent un bruit transcriptionnel constant et qui pourrait avoir un rôle physiologique (je suis pas du domaine, donc je sais pas ce qui se fait récemment là dessus).  [...]

Normalisation RT-PCR quantitative

Mais le problème de la méthode des delta delta de Ct, est que c'est de la quantification relative, i.e. mon gène est n fois plus/moins exprimé que tel autre. Si tu veux faire de la quantification absolue, il te faut faire une gamme-étalon avec des quantités connues d'ADN et comparer le Ct de ton gène cible avec les Ct de la gamme.  [...] Par contre, il faudra peut être que tu rapportes tes Ct à la quantité de RT (ou d'ARN total initial) dans certains cas. Car parfois, il faut diluer beaucoup pour avoir un Ct correct, c'est-à-dire non saturé et hors du bruit de fond. En gros, je gardais les Ct entre 20 et 35 (mais j'avais ma gamme d'ADNg pour me guider).  [...]