• Forum - Bandes, Puits, ADN, Extraits

[Biologie Moléculaire] Révélation des extraits d'ADN

je crois que je me suis trop précipitée avant de me poser des questions, les bandes bleues ont finalement révélées une fluorescence bien nette pour les premiers puits qui correspondaient à des ADN extraits avec un kit tout prêt.  [...] par contre la seconde série de puits correspondait à des ADN extraits à l'ancienne avec toute l'armada de solutions que j'avais eu tant de mal à préparer.  [...]

[Biologie Moléculaire] problèmes de PCR , à l' aide!!!

voila j'ai des ennuis avec mes extraits d' adn d' insecte. après PCR l'électrophorèse sur gel ne montre aucune bande.j'ai quantifié au spectrophotomètre et la quantité d' adn varie de 10 à 30 nanogrammes/µl, le rapport 260/280 est bonne pour la plupart, mais ne donnent pas de résultat après PCR.  [...] mon extraction a été faite avec instagene matrix, je ne sais pas si vous en avez entendu parler. mon PCR des fois cela marche et des fois non,je veux dire les échantillons, pourtant le témoin positif marche toujours donc je pense que le problème viendrait de mes extraits d'ADN et de leur pureté.  [...]

[Biochimie] Conservation ADN

Ma question concerne la conservation d'extraits d'ADN suspendus dans du TE, est il possible de les conserver à 4°C (frigo) durant une période de 3 mois environs pour une utilisation ultérieure. si ce n'est pas le cas, comment procéder.  [...] Que les choses soient quand même bien claires. Quand je parle de conserver à 4°C des extraits d'ADN, c'est pour faire des PCR simples type génotypage (c'est à dire en général moins de 500 pb). Pour toute autre application, j'emets quand même des réserves. Les extraits dont je parle sont des extraits propres.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de produit PCR d'ARN (ADNc)

Je suis nouvelle et je recherche de l'aide. je viens de purifier un extrait mélangé d'amplicons d'ARN (après RT-PCR) puis j'ai fait une migration sur gel d'agarose 3%-TBE 1X mais il n'apparait aucune des bandes attendues. Or, avant de mélanger ces extraits, ils ont présentés des jolies bandes.  [...] et mon but étant d'isoler ces bandes pour une extraction. Quel pourrait être mon problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème génotypage souris mutées

En fait, pour la petite histoire, je suis arrivée dans le labo en janvier et ils avaient déjà des soucis, à l'époque les extractions étaient sous-traitées à un autre labo (robot Qiagen). J'ai tout repris à zéro et j'ai fait moi-même les extractions avec le Direct PCR, j'ai modifié un peu le programme de la PCR et ça a très bien marché jusqu'à ce que je commence à avoir des blancs (aucune bande pour certaines souris) puis plus rien du tout.  [...] Je soupçonne ma méthode d'extraction car l'échantillon avec lequel j'ai retrouvé la 2ème bande n'a pas été extrait de la même façon que ceux que j'ai analysé ensuite (robot Qiagen vs tampon maison + PK), même si ça n'explique pas pourquoi j'avais perdu cette bande pour cet échantillon (dégradation ).  [...]

[Biochimie] Gel SDS

Si tu connais pas la tailles de ta protéine, je te conseille vivement d'utiliser un gel SDS en gradient 4-15% (par exemple) commercialisé. Sinon si t'as prot tu la vois vraiment en haut du gel et bien elle doit être de haut poids moléculaires donc tu devrais peut être préparer un gel de 6% pour voir un peu ce que sa donne.   [...] Que déposez vous exactement dans vos puits Si c'est un extrait cellulaire total alors c'est certainement un problème lié à votre gel de résolution car il n'est pas normal que toutes les protéines soient en haut du gel (si c'est un extraits, tous les poids moléculaires seront représentés).  [...]

Pb sur un exercice sur l'ADN

Par des méthodes chimiques, on extraits des souris S un acide nucléique,l'ADN. Cet ADN est mis en contact in vitro, avec des bactéries R.Ces dernières sont injectés à des souris. chaque souris meurt de pneumonie et on retrouve dans son corps des bactéries S.  [...] pour la question 2, je pense qu'il faut sité les témoins utilisés pour l'expérience. il faut d'abord un lot de souris non infectées avec des bactéries, elles sont saines. ensuite il faut un lot avec les bactéries S (qui vont mourir)et un autre avec les R (qui seront saines).   [...]

[Biologie Moléculaire] RNA et coomasie

J'ai fais une manip de purification de chromatographie d'affinité (ARN fixés sur une résine et incubés avec des extraits nucléaires) et déposé les protéines fixées sur un gel d'acrylamide. J'ai coloré au bleu de coomassie et envoyé les bandes intéressantes en spectro de masse pour identification.  [...] Cependant, une des bandes les plus intenses, se situant vers 10-15 kDa ne donne rien en spectrométrie (même en MS/MS...) ça me parrait vraiment bizarre vu que les résultats de spectro pour les autres bandes sont parfait.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Si ce sont des extraits que tu as déposé, les autres bandes sont soit du non spé, soit des formes modifiées de la protéine comme des phosphorylations qui peuvent provoquer d'importants shifts de migration, soit des isoformes mais pour moi ce n'est pas la première piste à explorer.  [...] Pour vérifier l'intégrité de l'ARN, ce qu'on peut faire c'est RT PCR circulaire. Tu extrait les mRNA, ligation sur eux mêmes puis PCR. Mais je sui d'accord avec les autres l'explication dues aux ARN me parait pas convaincante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de la trypsine pour un test de repliement des protéines

Je viens de découvrir une nouvelle méthode qui consiste à traiter des extraits cytoplasmique avec de la trypsine (1, 3, 10...µg/ml) pendant 5 min, faire un western blot avec un anticorps pour la (les) protéine(s) d'intérêt et regarder si les bandes observées sont à hauteur attendue (bonne taille en KDa), ou avec des tailles inférieures ou si elles ont complétement disparu.  [...] Si les protéines sont résistantes à un traitement à la trypsine à forte concentration c'est qu'elles sont bien repliées et donc moins accessibles à cette protéase.   [...]