• Forum - Bandes, Plasmide, Bactéries

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

coli. Ensuite il a fait une sélection blanc/bleu pour distinguer les bactéries contenant les plasmides recombinants des non recombinants. Ensuite, on nous a donné à nous, les étudiants, deux souches A et B. On nous a demandé de lyse les bactéries, puis après plusieurs étapes de purification on a obtenu les plasmides seuls.  [...] Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A.  [...]

interpretation electrophorese d'un plasmide purifié

Bonjour et bien non y'a pas eu digestion par des enzymes en fait on just purifier et on a fait une electrophorese. on a plusieurs puits parcequ'on etait nombreux et chacun a deposer son plasmide purifie.Merci.  [...] moi je vois qu'on a deux bandes une légère qui correspond a l'ADN génomique de la bactérie et la bande épaisse en dessous c'est notre plasmide circulaire purifié.  [...]

[Biochimie] Restriction bizarre

- pourquoi n'avons nous pas obtenu les meme bandes, lorsque le plasmide n'a pas été soumit a une restriction (piste 1 et 4) alors que les conditions été iden,tiques et le plasmide censé etre le meme.  [...] et pour BGIII. minimum 2 bandes (si le site ou a été coupé le plasmide est un des sites de restriction de BGIII) ou 3 bandes. Mais ou ce placeraient elles sur le gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] le clonage impossible, ou comment se prendre la tete...

Comme toi je digère mon plasmide avec 2 enzymes de restriction qui produisent des bouts cohésifs complémentaires (XbaI et NheI), puis je fais migrer sur gel (mais je colore avec du BET) puis je découpe mes bandes, purifie sur colonne en utilisant le même kit de purification que toi, puis je fais une ligation o/n à 16°C.  [...] J'ai également tenté d'insérer ma séquence codante dans un autre plasmide d'expression. là je digère mes deux plasmides (le vecteur vide et mon plasmide parental ) avec EcoRI et XbaI et j'ai testé les rapports 1.3 et 1.9. Lorsque je fais migrer mes produits de ligation, je ne vois plus mon vecteur vide mais des bandes qui pourraient correspondre à mon plasmide avec insert surenroulé et non surenroulé, ainsi que des concaténaires d'insert. Et là encore, je n'ai pas de colonie.  [...]

[Génétique] electrophorese

Du coup quand on fait migrer un plasmide circulaire, on ne doit pas s'étonner de voir plusieurs bandes apparaitre. Je note que les différents superenroulements sont en quantités discretes donc on ne voit pas un smear mais bien plusieurs bandes.  [...] En général, pour résoudre ces problème on linéarise le plasmide ce qui résoud tous les superenroulements et on n'a plus qu'une seule bande de la taille du plasmide. Si il reste des bandes c'est soit que l'enzyme coupe mal soit qu'il y a du simple brin.  [...]

[Génétique] Electrophorèse d'un plasmide avec 5 bandes

Je suis étudiant et j'ai un problème pour l'interprétation d'un gel, en effet après extraction d'un plasmide, j'obtiens non pas les trois bandes attendus (super enroulées, linéaire, et circulaire), mais cinq bandes, après recherche j'ai trouvé qu'il peut y avoir deux explications.  [...] Le coup du plasmide simple brin n'est jamais évoqué dans les cours alors qu'il est relativement fréquent d'en sortir lors des preps. Il passe inaperçu lors d'un clonage classique vu que la bactérie va s'empresser de synthétiser le complémentaire. Le problème c'est que cet abruti ne peut pas être coupé par les enzymes de restriction.  [...]

électrophorèse: pk plusieurs fragments

Ce que je trouve bizarre, c'est que si on peut avoir plusieurs formes de plasmides, pourquoi est ce que dans les puits de mes camarades, on retrouve exactement les mêmes fragments, à la même distance... et ils en obtiennent 2 aussi, comme moi.  [...] Première chose, si tu es en présence des fragments de plasmide ils sont nécessairement linéaires. Ensuite tu peux avoir un plasmide circulaire et super enroulé qui font que tu as deux bandes très hautes sur ton gel. Pourrais tu nous donner la taille de ton plasmide théorique et celles des deux bandes que tu observes.  [...]

[Biotechnologie] Ligation

Deux fragments d'ADN (provenant d'ADN plasmidiques différents) sont purifiés puis digérés par Bam HI. Le premier fragment fait 200 bp et le second 700 bp. On veut fusionner ces deux fragments en présence d'ADN ligase.  [...] Tu ne peux pas imaginer retrouver sur ton gel le plasmide non digéré et le plasmide digéré ce qui expliquerait les grandes bandes.  [...]

Casse tête de PCR

Mon problème ce situ au niveau de ma PCR visant à amplifier mon plasmide. J'obtiens après chaque run et sur un gradient d'hybridation allant de 58 à 67°C des bandes non spécifiques (4 ou 5) a des tailles comprises entre 1.5kb et 1kb alors que la taille de mon fragment attendu est de 6.5kb environ.  [...] Voila ou j'en suis je précise que j'ai linéarisé mon plasmide sur gel et purifié la bande pour tenter de résoudre le problème sans résultat. J'ai aussi essayé une première fois avec des amorces simples (sans bras d'homologie 29pb) j'ai eu ces bandes non spécifiques mais également mon plasmide amplifié alors que l'emploi de Méga amorces (amorces simples + 50pb homologues a la séquence a insérer) n'a donné que de l'amplification non spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème transfo...

Non, l'une des extrémités est coupée par BamHI, l'autre par NcoI. Ceci n'explique d'ailleurs toujours pas l'histoire du plasmide fantôme... Pour moi, c'est une contamination. mes bactéries ont choppé une MST.  [...] Ca n'a rien a voir avec de la SF, il y a meme fort a parier que les origines de replication des plasmides de bacillus soient completement differentes des origines des plasmides de coli. Ca demande a etre verifie, mais si ton plasmide n'a pas une origine coli, ca risque de poser probleme.  [...]