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[Biochimie] Mutagénèse dirigée

D'apres ce que tu as décris, il me semble que tu essayes de transformer les bactéries avec seulement le produit de PCR et que tu ne mets pas le plasmide. Ce dernier, qui doit surement contenir un gène de résistance aux antibiotiques, ne peut donc pas empêcher les bactéries de mourir au contact du milieu LB+ampicilline.  [...] Néanmoins, ce genre de problème m'était arrivé une fois et cela avait été résolu en augmentant la quantité de produit pour transformer les bactéries. Donc ça peut vraiment être une solution.  [...]

taille d'insert maximum à liguer dans un vecteur

Sinon, quand le plasmide produit est grand, il faut mieux transformer les bacteries par electroporation que par heat-shock. La qualite des bacteries est bien sur cruciale pour les clonages delicats.  [...] merci à tous les 2, je vais essayer comme ça, bien que j'ai déjà utilisé l'enzyme CIP, que j'ai essayer en ratio 3 et 10 et je transforme mes bactéries par électroporation.  [...]

Help please ! Design d'amorces pour l'insertion de 3 nt

Bonjour, si cette séquence est contenue dans un plasmide, le plus simple est de faire une mutagénèse dirigée. CàD, faire un couple d'oligos complémentaires avec en leur centre les 3nt à ajouter avec au moins 15nt de chaque côté pour un Tm total d'environ 78° C.  [...] Ensuite amplifier le plasmide par PCR, digérer par DpnI la matrice et transformer des bactéries avec ce produit.  [...]

Vos conseils pour mon PTA.

Une troisième idée qui vient de me venir à l'esprit en écrivant ce topic. Ne pourrions nous pas réaliser un enrichissement sur un morceau de viande contenant très peu de mauvaises bactéries puis par la suite utilisé des phages de lyses spécifiques à ces mêmes bactéries afin d'obtenir une viande de nouveau consommable.  [...] J'ai une idée mais franchement, je sais pas si faisable. Ce serait de modifier le plasmide ou l'ADN ( un peu comme le sujet de bac mdr) et de permettre à une bactérie ( ou autre chose ) de synthétiser quelque chose de simple, de récupérer le produit et voir même de le purifier ( si c'est pas possible d'acheter des bactéries modifiées et de raconter comment vous avez fait).  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

Ce que je comprends c'est que vous avez fait une mutagénèse dirigée par PCR à partir d'un plasmide X. Pour éliminer le plasmide matrice X vous avez utilisé la spécificité de l'enzyme de restriction DpnI pour les sites méthylés. Ainsi, l'enzyme a digéré le plasmide matrice, produit en bactérie (donc méthylé) et pas le plasmide produit par PCR, non méthylé.  [...] Tu as 2 transformations distinctes en fait. Une première, avec les bactéries, qui te sert à amplifier le plasmide et réaliser la mutagenèse dirigée. Ensuite, tu récupère ton bluescript et tu transfert dans le vecteur POZ. Ensuite, tu transformes des cellules eucaryotes avec le vecteur POZ.  [...]

[Microbiologie] bacterie resistantes

je dois cultiver des bactéries possédant un plasmide de résistance à un antibiotique. Dans le bouillon, je dois mettre cet antibiotique. Je ne comprends pas pourquoi puisque les bactéries sont résistantes Pouvez m'éclairer.  [...] - Lorsqu'on insère un plasmide dans des bactéries, certaines bactéries du lot n'insèrent pas le plasmide et restent donc non résistantes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clone sans ADN

Ensuite, une transformation dans les bactéries de type DH5 alpha a été effectuée. Le produit de ligation à été ajouté aux bactéries et incuber 30 minutes sur glace. Ensuite, on place le tout à 42° C pendant une minute, puis 10 minutes de nouveau sur glace.  [...] Vous sélectionnez avec de la kanamycine ou de la spectinomycine La carte de chez stratagene (qui produit le plasmide que vous utilisez) indique qu'il y a dedans un gène de résistance neo/kana. On peut se demander si vos bactéries résistent à la spectinomycine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Proteines recombinantes

Je ne comprends pas comment on peut utiliser les plasmides pour produire des protéines pour l'utilisation médicale par exemple l'insuline (on tire profit de l'opéron lactose). Comment est-ce qu'on force les bactéries à garder le matériel génétique introduit et comment ça se fait qu'il y a une partie des bactéries qui n'est pas transformé par le plasmide (qu'est-ce qu'on fait avec cette partie).  [...] Les protéines n'ayant pas intégré le plasmide vont donc crever, on ne fait rien avec. Pourquoi toutes les bactéries n'intègrent pas le plasmide Pas vraiment de réponse, ça dépend de beaucoup de choses, c'est un peu comme les transfections pour les cellules eucaryote, tu n'as jamais 100% d'intégration et tu dois valider tes transfections.  [...]

OGM (l'identification du/des gènes intéressant(s))

je m'interesse aux OGM et j'aimerai savoir comment concretement les scientifiques procèdent pour,une fois qu'ils ont identifié pour une fct° d'un être vivant la ou les protéines qui sont à l'origine de cette fonction (quand je parle de fonction c'est par exemple le fait qu'une bactérie puisse produire une protéine insecticide, ici ce sera sa fonction intéressante), ils retrouvent le gène qui est à l'origine de cette protéine.  [...] Pour le vérifier on l'insère dans un plasmide bactérien et on transforme des bactéries. En cultivant ces bactéries sur un milieu permettant de différencier celles qui produisent notre molécule d'intérêt et celles qui ne la produisent pas, on récupérer les bactéries contenant le gène codant pour la synthèse de cette molécule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Mais là j'ai un problème. la résistance à la streptomycine se trouve sur le vecteur et non sur l'insert. Donc dans ce cas nous sélectionnons simplement les bactéries qui ont un plasmide (avec ou sans insert).  [...] Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt). Plus intéresant serait de faire une construction avec LacZ à la place du gène de la béta-Lactamase.  [...]