• Forum - Bactéries, Plasmide, Résistance, Beta

[Biologie Moléculaire] Identification d'un gène déterminé

Disons que j'ai de bactéries. Bactéries 1 a une résistance aux antibiotiques des béta-lactamines encodé dans un plasmide. Ce gène bien connu est le gène bla.  [...] J'ai une bactéries ayant un plasmide contenant une résistance aux béta-lactasame. Le gène de cette résistance est le gène bla. Je connais donc sa séquence. Et je voudrai vérifier sur des bactéries (E.coli U12 HB101), porteuses de cette résistance, si ce gène peut être transporté/ incorporé du plasmide dans leur le patrimoine génétique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Proteines recombinantes

En réalité l'insuline a 2 chaînes polypeptidiques reliées par des ponts disulfures. En pratique on va mettre 2 transgènes dans E.coli (donc deux constructions plasmidiques différentes), un pour chaque chaîne. Et pas n'importe comment. Déjà les deux plasmides auront un gène de résistance à l'ampicilline, un antibiotique.  [...] Dans un premier temps E.coli va croître dans un milieu sans lactose et en présence d'ampicilline. Cela permet d'éliminer les bactéries n'ayant pas intégré le plasmide recombinant (et donc le gène de résistance) et d'obtenir les bactéries d'intérêt, sans transcrire la beta-galactosidase et la chaine d'insuline.  [...]

phage M13 et transformation bactérienne

Si j'ai bien compris le phage M13 est un phage possédant un ADN simple brin qui infecte les bactéries possédant uniquement le pilus F dans lesquelles il duplique son génome sous forme RF puis au bout de plusieurs cycles de réplication on aura uniquement synthèse asymétrique du brin initial sans lyse des bactéries.  [...] Enfin il me semble qu'on utilise des bactéries spéciales possédant un épisome F' contenant une résistance à la tétracycline pour son maintient. Est ce que ces bactéries possèdent aussi un opéron lactose ne synthétisant qu'une partie de la beta galactosidase de manière à ce qu'il y ai un gène marqueur.  [...]

[Microbiologie] Milieu chromogène

Le milieu chromogène permet de faire les deux en même temps, on peut sélectionner des bactéries selon leur résistance à des antibiotiques, l'utilisation de sucres, etc. plus la présence d'une enzyme spécifique grâce au chromogène. Exemple classique. le X gal qui est dégradé par la béta gal et donne une couleur bleue.  [...] Pour les géloses chromogènes, les colorants ne sont pas des pigments - des déchets issus du métabolisme bactériens. C'est bien le métabolisme particulier d'une souche qu'on cherche à mettre en évidence.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

Si tu veux sélectionner les bactéries sensibles à l'amp, tu dois procéder comme ça. (donc pour rappel, tu cherches les bactéries amp sensibles, antibio 2 resistantes, antiobio 3 resistantes cad a dire portant le plasmide ou la résistance a l amp est altérée par un insert (mais les deux autres restent effectives).  [...] Tu fais ta transfo sur l'antibio 2 ou 3 (tu as dis que tu avais 2 autres résistances sur ton plasmide qui ne doivent pas être altérées par ton insert). Ca veut dire que seul les bactéries portant le plasmide (transformées) seront sélectionnées.  [...]

operon

On utilise une bactérie déficiente pour un gène codant la beta galactosidase, ce gène étant grand c'est un petit fragment en n-terminal qui est tronqué dans la bactérie, la version fonctionnelle est dans le plasmide.  [...] Lors de l'insertion du plasmide on a donc une bactérie partiellement diploïde pour une certaine zone du chromosome. Ceci est intéressant car il y a un phénomène de complémentation cis-trans entre le génome plasmidique et bactérien permettant de constituer un gène codant pour la beta gal et donc qui en présence de Xgal et IPTG donnera une couleur bleue.  [...]

[biologie moléculaire] Opéron lactose

merci de m'avoir répondu YOYO,dans des article je trouve qui parle du lacZ comme étant le gène qui code pour le béta gal.Le lacZ n'est exprimé q'en présence de lactose.En experimentation on ajoute IPTG qui induit a la transcription du lac Z en Béta gal mais qui est inactive.  [...] ensuite lors de la sélection des clones recombinantes(les bacteries ayant incorporé un vecteur recombinant)on ajoute autre que l'antibiotiqe,de l'x-gal (incolore)qui vas etre cliver par le beta galogtosidase toute en produisant une coloration bleue,donc l'obtension de cette coloration indique qu'on est en présence des bacteries trasformeés par un plasmide intact.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification et purification de plasmide

Sans bactéries, plusieurs semaines. Si des bactéries résistantes recrachent une enzyme comme la bêta-lactamase, tu peux épuiser un milieu liquide en quelques heures. C'est la diffusion de cette enzyme sur les milieux gélosés qui est responsable de l'apparition de colonies satellites sur les boîtes ampi qu'on a oublié à 37°C pendant le week-end.  [...] De deux choses l'une. soit ta combinaison plasmide/bactérie donne un faible rendement, soit ta technique de purif ne marche pas. Je te conseille de garder un aliquot (1.5ml) de tes bactéries avant de les lyser pour ta prep sur colonne. Fais une miniprep classique sur cet aliquot (lyse alcaline + isopropanol) et estime ton rendement en plasmide.  [...]

[Biologie Cellulaire] Expression stable: perte du transgène

j'essaie de produire des lignées stables en les transfectant (via liposomes) avec un vecteur plasmidique portant un gène de résistance (sélection au G418) et gène rapporteur (beta galactosidase). Les lignées (293 et CHO) présentent une bonne expression transitoire à 48h, mais quand je passe à la sélection au G418, les 293 meurent en une semaine et pour ce qui est des CHO j'obtiens des clones résistants au G418 (à partir de trois semaines et plus) mais qui n'expriment pas beta gal.  [...] Je précise que j'ai bien linéarisé le plasmide en dehors des séquences résistance et rapporteur avant la transfection. Comme c'est la première fois que je tente ce genre d'expérience, je ne sais trop comment améliorer la chose. intégration du gène de résistance ET du gène rapporteur (puisqu'il semblerait que je le perde). Quelqu'un a-t-il une idée.  [...]

Les bactériophages ??

Apparemment ça dépend de bactériophages. on utilise certains bactériophages très spécifiques pour identifier certaines bactéries, mais par contre, si mes souvenirs sont bons, les bactériophages s'attaquants par exemple ux E. coli sont peu spécifiques.  [...] exemple. -La Diphterie est imputable au bactériophage beta porteur du gène tox chez Corynebacterium diphteriae. La toxine botulique est également bactériophagique. Concernant V. cholerae je pense que le gène de la toxine est portée non pas par un phage mais un plasmide.  [...]