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[Génétique] clonage orienté ou non

On transforme directement les bactéries avec le fragment PCR et le plasmide linéarisé. Et là, la recombinaison homologue fait le reste.  [...] Elles font ca les bacteries classiques il me semblait qu'elles etaient recA- pour eviter les remaniements dans les plasmides, mais que du coup elles ne font plus de recombinaisons. Chez la levure 50nt est le minimum obligatoire pour faire cela et la levure fait bcp de recombinaison homologues or il me semblait que pour coli faisait mal la recombinaison homologue.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.  [...] le but c'était de faire des recombinaisons chez la levure et de pouvoir électroporer directement le YAC dans les bactéries. Le vecteur possède 2 ori procaryotes car je l'ai construit en ligant des fragments de deux vecteurs différents (et je croyais avoir supprimé une des 2 oris mais après séquençage elles y sont toutes les deux).  [...]

Expériences en génétique…

J'ai donc un peu repondu de travers à la question en expliquant comment recuperer un gène introduit dans une bactérie grace à un plasmide. Dans ce cas là, comme on connait le plasmide, il n'y a pas à chercher à identifier le gène. On connait la taille du fragment de restriction, c'est tres simple.  [...] Les gènes de résistance aux antibiotiques portés par ces plasmides naturels ont été caractérisés il y a un bout de temps, et on les utilise maintenant pour sélectionner les bactéries ayant reçu le fragment d'ADN voulu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Principe des banque génomique/cDNA

On ne parle pas de dégradation par des enzymes de restriction, mais de digestion. La différence est quand même notable. avec le terme dégradation je signifie le fait que je pars d'une macromolécule (ADN) pour me retrouver avec des nucléotides à la fin. Alors que le terme digestion signifie que je vais couper à certains endroits pour me retrouver avec des fragments de tailles différentes.  [...] On est d'accord qu'on cherche à assembler des petits bouts qui vont constituer un gros bout (des fragments de tailles différentes faisant partie d'un gène). Donc, peux-tu déduire de cette idée l'importance des bouts chevauchants.  [...]

plasmide-clonage

en fait le plasmide porte un tout petit fragment (N-terminal) de la Bgal. Le reste de l'enzyme est codé par le chromosome. uand les deux morceaux sont exprimés l'enzyme est fonctionnelle et ca donne du bleu, quand le petit n'est pas exprimé alor l'enzyme n'est pas fonctionnelle et ca donne du blanc (du moins en theorie).  [...] Que la bactérie pousse veut dire qu'elle a reçu le plasmide (contenant le gène de résistance à l'antibiotique), pas forcément le plasmide avec le fragment d'ADN qui t'interesse dedans. Il faut alors vérifier.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

on met les différents fragment dans un plasmide, et c'est là que rentre en jeu les enzymes de restriction, donc quand on dit que le plasmide a un site de restriction BamH1 cela veut dire que c'est cette enzyme BamH1 qui va cliver un bout du fragment du gène.  [...] on met (on insert) les différents fragment dans un plasmide, et c'est là que rentre en jeu les enzymes de restriction, donc quand on dit que le plasmide a un site de restriction BamH1 cela veut dire que c'est cette enzyme BamH1 qui va cliver un bout du fragment du gène.  [...]

operon

On utilise une bactérie déficiente pour un gène codant la beta galactosidase, ce gène étant grand c'est un petit fragment en n-terminal qui est tronqué dans la bactérie, la version fonctionnelle est dans le plasmide.  [...] Dans notre cas, le plasmide avec insert possède cet insert dans le gène lacZ ce qui rend non fonctionnel le gène (pas d'alpha complémentation), lacZ ne peut donc pas coder pour le fragment amino terminal de la B-galactosidase.  [...]

Intégration dans un plasmide

Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.  [...] C'est pour cette raison qu'on utilise un vecteur d'ADN circulaire pour introduire un gène dans une bactérie. Ce vecteur est souvent un plasmide modifié (avec de nombreux sites d'intégration possibles, un promoteur fort avant ces sites, des gènes de sélection pour pouvoir distinguer les bactéries qui ont intégré le plasmide...).  [...]

ADP et Pi

La bactérie Agrobactérium qui t'interesse vit autour des racines (rhizosphère) et résiste à des températures assez variables. Mais le transfert du fragment de plasmide qui provoque le Crown gall, ne se fait plus au-delà de 28°C. Ce serait une perte des gène de virulence.  [...] Je ne connais pas la températue limite inférieure, mais il me semble que l'optimal d'infection est de22°C alors tes 20°C me semblent un peu élevés pour des valeurs minimales.   [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

On obtient 4 fragments, on désire obtenir un fragment de 704 pb (la moitié 5' du gène), qu'on liera sur un autre plasmide pSK lui aussi coupé par ces deux enzymes (pour avoir les bonnes extrémités). Ce plasmide pCR fait 5484 pb.  [...] Je crois, la concentration initiale de l'ADN plasmique initiale EST juste la concentration initiale du fragment digéré dont tu as besoin, parce que pour un plasmide, il n'existe qu'UN fragment de 784 bp qui est celui que tu cherches (la moitié 5' du gène, oui ).  [...]