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[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

petit détail, la sélection des bactéries par l'ampicilline sert à savoir si la bactérie possède le plasmide, mais cela ne donne pas d'indication si le gène codant la protéine a bien été inséré dans ce vecteur.  [...] Ensuite il faut insérer tout les plasmides dans une bactérie lambda, effectuer une transformation bactérienne pour rendre la protéine native inefficace. Puis la bactérie portant le bon plasmide est sélectionnée parmi toutes les autres sur un milieu nécessitant la protéine d'intérêt (or le gène natif ayant été muté, la protéine ne pourra provenir que du plasmide).  [...]

PCR et vecteur de clonage

La bactérie pour se multiplier va répliquer son génome et le plasmide contenant le gène A. Au final tu obtients donc un plasmide d'expression, en grande quantité, et contenant le gène d'intérêt. Tu peux également récupérer la protéine A (synthètisée par la bactérie car codée par le gène A) dans ton milieu de culture.  [...] L'insert, s'il est présent, va être multiplié mais on en a pas l'utilité vu que les bactéries ont déjà du faire ce travail Ne serait-il pas plus simple de digérer le plasmide dans les enzymes de restriction spécifiques de l'insert, et de vérifier si l'insert est présent en faisant une électrophorèse.  [...]

Hépatite B

Dans un de mes cours, j'ai vu que le vaccin pour l'hépatite B est un vaccin viral inactivé à sous-unité recombinante -. insertion du plasmide contenant le gène codant pour la protéine dans un système d'expression cellulaire (levure, bactérie, baculovirus) permettant l'expression in vitro de la protéine. Ex. le vaccin HBVAXPRO 10 µg de Sanofi.  [...] Et dernièrement, certains ont fait des tests avec des vaccins à ADN nu pour les porteurs chroniques de l'hépatite B. Vaccination par ADN (ou ARN nu). introduction directe dans certaines cellules de l'organisme du gène codant pour l'antigène vaccinal (plasmide contenant le gène pour le peptide antigénique).  [...]

[Biochimie] nucléase

Le moyen couramment utilisé en labo est de virer le groupement phosphate des extrémités 5' générées après coupure. Pourquoi ne voudrais-tu pas que ça se réassocie. exemple, tu veux exprimer une protéine dans une bactérie pour l'étudier. tu insères le gène codant pour ta protéine dans un plasmide d'expression bactérien qui contient donc une cassette de clonage.  [...] Ta protéine fait donc 3 acides aminés (on est dans de la science fiction hein ) puisqu'on a 3 triplets AAA puis AAC puis CCC (puis 3 codons, 3 aa). Si ton insert se fout dans l'autre sens, càd comme ça dans ton plasmide.  [...]

Problème de rendement kit Maxiprep

Tu as dit que tu utilisais une souche d'expression, pour peu que ton gène possède tout son CDS et qu'il y a un promoteur dans le plasmide, si la bactérie l'exprime correctement il se peut que cette protéine ait un effet,  [...] bien souvent quand ca arrive, on observe plutot un auto-empoisonnement et donc elles ne se reproduisent pas, donc vu que tes bactéries se développent il n'ya pas auto-empoisonnement, mais on sait jamais, si c'est une protéine qui joue sur la régulation des plasmides ou sur les séquences génétiques (sans toucher au chromosome et donc a la viabilité) peut etre que ta protéine est la cause.  [...]

[Génétique] Conséquence de l'intégration d'un vecteur dans une bactérie

Oui c'est ça que je voulais qu'elle comprenne toute seule. si elle a plus de boulot à faire que les autres du TP elle mettra plus de temps -. la bactérie qui doit fabriquer le plasmide et synthétiser la protéine est ralentie dans sa multiplication.  [...] Seule exception. quand on transforme une souche avec un plasmide, il faut la laisser un moment (45 minutes il me semble) en milieu non sélectif, pour qu'elle ait le temps d'exprimer la protéine de résistance. Mais elle n'a alors pas le temps de se diviser et de perdre le plaqmide.  [...]

ADN recombinant et plasmide

Bonjour, oui c'est bien cette diapo. J'en ai déduis que le plasmide ne provient pas de cette bactérie car elle a déjà ses chromosomes, normalement si ce serait le plasmide de la même espèce de bactérie alors elle n'aurait pas de chromosomes mais des plasmides, non X et Y sont des bacteries d'espèces différentes.  [...] Bonjour, merci beaucoup, en effet je pensais que le plasmide provenait d'une bactérie, mais on est d'accord que le plasmide existe vraiment dans la nature (c'est à dire chez certaines bactéries).  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

Ensuite, tu l'insert dans un plasmide, possédant une origine de réplication E.Coli, avec un gène de sélection (ex.. Résistance à lampiciline).  [...] Mais, tu va devoir modifier ton transcrit d'ADN c de départ pour par exemple utiliser les ARNt que la bactérie utilise le plus souvent, et aussi, tu peux, par PCR, ajouter une séquence à ton plasmide permettant de secréter la protéine dans l'espace périplasmique ou extracellulaire.  [...]

[Biochimie] Nickel et congélation ...

Sinon, plutot que d'éviter à tout pris que ta protéine ne s'agrège... pourquoi ne pas utiliser cette caractéristique comme moyen de purification.  [...] Heureusement que j'avais tout noter...ou presque...et oui mon problème se situe là... Je vais pas vous faire attendre plus longtemps j'aurai besoin d'un protocole de surproduction de protéine et de purification, ma prot fait dans les 15Kda et je l'avais fait par colonne de nickel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Exprimer une protéine fonctionnelle en plasmide

Mais en fait il provient d'où ton ADN, parce que est ce qu'un ADN humain par exemple pourra bien s'exprimer dans une bactérie Autrement dit, est ce que la bactérie possède les éléments necessaires pour épisser un gène d'origine différente que le génome bactérien.  [...] Mais seul le cDNA suffit à exprimer la protéine nan En considérant biensur que le promoteur soit déjà dans le plasmide Parce que en fait je ne comprends pas bien l'histoire de l'intron avant l'ATG.  [...]