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[Biologie Moléculaire] hybridation in situ

je veux réaliser une hybridation in situ en utilisant des sondes marquées par cy3 et FAM sur des cellules d'amibes, je veux savoir est ce que la température (Tm) intervient dans la réaction d'hybridation.  [...] si oui, dans un article publié dit que la température d'hybridation ne doit pas passer 52°c pour ne pas perdre le signal, que je doit faire la réaction n'a pas marché, j'ai changé tout les paramètres sauf la T°, que je doit faire pour que la réaction marche.  [...]

Température d'hybridation et PCR

J'ai déterminer un Tm de 52°c avec les amorces mais dans l'article ils utilisent une température d'hybridation de 54°. est-ce parce que en dessous de 54° l'hybridation n'est plus assez spécifique.  [...] Oui mais il faut bien que l'ADN soit suffisamment dénaturer sinon l'hybridation n'est pas possible sur de l'ADN bicaténaire. Et c'est bien pour cela qu'on prend comme référence le Tm qui en fait est une température de demi-dénaturation.  [...]

[Biochimie] Hybridation dans southern blot

Quand tu as fini de faire monter la témpérature à 100 degrés quand l'adn va être séparer au moment de revenir à température normal, tu incorpores ta soude à une témpérature très elevée par rapport à ce que cela aurait du être. Tu as donc forcement plus de chance que l'hybridation soit très précise ( à utiliser dans des cas d'analyses d'emprintes génétique précise).  [...] Ta sonde est de plus en plus spécifique si elle est de grande taille. mais n'oublie pas qu'une hybridation (= fixation cible/sonde) dépend aussi de la température. Selon la température, tu peux fixer une sonde sur une région qui ne lui correspond pas du tout. tu obtiens alors des faux positifs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

le programme classique de PCR ne marchant pas, il a été modifié (étape d'hybridation passé de 52 à 50°C) c'est avec ce changement+ des variations de quantité d'ADN que j'ai réussi a obtenir 1-2 fois un très léger signal (sur gel agarose 1%+BEt), mais depuis plus rien, tout a été testé (augmentation du temps d'élongation, des concentrations en ADN, passage de l'étape d'hybridation a 50 et 45°C durant 2min et température augmentée, TA cloning) je suis donc dans une impasse puisque je n'arrive pas a obtenir cet insert, donc si vous avez des idées je suis preneur. merci.  [...] A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.  [...]

températures et PCR

Je comprends bien qu'il faut une forte température pour dénaturer les GC mais du coup il faudrait une température d'hybridation faible non Donc je me suis trompée.  [...] Pour que tes amorces puissent s'hybrider à la matrice d'ADN, il faut que celle-ci sois dénaturée pour permettre l'accessibilité des amorces. Ainsi à Tm-5°C on considère que l'hybridation peut se faire correctement. Et oui, le Tm est la température à laquelle tu as 50% de ton ADN sous forme simple brin (et donc 50% en double brin).  [...]

[Biologie Moléculaire] intensification du signal en hybridation in situ

[Biologie Moléculaire] intensification du signal en hybridation in situ.  [...] J'ai certaines sondes en S35 très pâle en hybridation (ARN-ARN) et j'aimerais intensifié le signal. Avez-vous des trucs.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : bandes aspécifique et température

J'ai commencé avec une température d'hybridation volontairement inférieur à celle du Tm de mes amorces car j'ai amplifié un autre insert dans le même programme de PCR.  [...] Comme cette fois je n'avais qu'un seul produit à amplifier j'en ai profité pour augmenter ma température hybridation afin d'être plus proche des Tm de mes amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème amorce PCR

Ben vu tes Tm il faut faire une hybridation à basse température (on conseille en générale 5°C en dessous du Tm théorique). Mais a 40°C ton oligo de Tm 60° va s'hybrider spécifiquement n'importe ou.  [...] Oui en effet, avant j'utilisais une température d'hybridation de 54°C mais j'ai baissé à 48°C pour voir si il y avait un changement. Et même après cette baisse de température je n'observe toujours rien sur le gel. Je vais donc refaire le couple en espérant que cette fois-ci, ça fonctionne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Besoin explication température d'hybridation

pourtant la température d'hybridation utilisée dans le thermocycleur varie de 59 à 45 °C (intervalle de 1 °C a chaque cycle), alors que j'aurais pensé qu'il fallais une Ta de 63°C.  [...] En PCR on cherche à ce que le maximum d'amorces soient hybridées (dans l'idéal 100%). Alors on se place générallement 5°C (voir plus) en dessous du Tm (c'est la température d'annealing ou Ta).  [...]

[Biologie Moléculaire] Température de fusion de l'ADN (Tm)

Il suffit de voir les derniers articles sur cette question. la plupart des molécularistes mettent 55 ou 57°C en température d'hybridation même si leurs amorces devraient beaucoup plus haut.  [...] Mettre une température plus basse n'est pas très embêtant sauf pour un point, on augmente le risque de mésappariement et donc d'avoir des faux positifs.  [...]