• Forum - ARN, Ménage, échantillons

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

Il n'y a pas besoin d'etre quantitatif vu qu'a la base l'urine doit etre sterile. De plus quantifier sous entends normaliser les echantillons, utiliser un gene de menage, une gamme de quantification, des oligos parfaits etc... -. complique et sans interet.  [...] Merci pour toutes vos réponses. Si j'ai bien compris, la PCR en temps réel (après reverse transcription dans ce cas) repose sur la détection de la fluorescence à chaque cycle à l'aide d'un thermocycleur et elle peut être quantitative (normalisation de la quantité d'ARN de départ dans tous les échantillons, choisir un gène de ménage, réalisation de gammes.  [...]

[Immunologie] Normalisation de données issues d'un séquençage NGS (ARN)

Le principe de la normalisation des données, c'est qu'au cours du processus d'extraction, purification, RT, etc, tu peux perdre une fraction significative de tes ARNs. Du coup, d'un échantillon à l'autre, les quantités d'ARNs varient totalement. Mais les rapports de concentrations entre gènes (au sein d'un réplicat), ou de gènes de ménages au sein de ton expérience, ne changent pas.  [...] Ce que ces algorithmes effectuent, c'est rechercher un groupe de gènes, dits gènes de ménage dont les rapports de concentration sont les mêmes au sein des réplicats et également entre les échantillons. Une fois ceci fait, toutes les concentrations des autres ARNS sont normalisées par ces gènes de ménage, ce qui permettra d'identifier des changements.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

Lorsque tu auras compris le Ct tu verras que le delta Ct est logique. C'est la différence entre le Ct du gène que tu veux analyser et le Ct du gène rapporteur ou gène de ménage. Ainsi tu peux avoir une valeur relative d'expression de ton gène d'intérêt. En fait ton gène de ménage sert à normaliser tes valeurs pour pouvoir comparer différents échantillons.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gammes pour calcul de l'éfficacité de la RT-qPCR

c'est l'efficacité de la gamme de l'echantillons ou l'éfficacité de la gamme du gène de mènage.  [...] L'efficacité est propre a un protocole donné, c'est à dire amorces, mix réactionnel et programme d'amplification. La seule façon de calculer l'efficacité d'une PCR est de faire une gamme de concentration en parallèle des échantillons pour chaque couple d'amorces utilisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calibration qRT-PCR sur cellule unique

Je me demandais dans le cas où l'on réalise une qRT-PCR sur les ARNm provenant d'une cellule unique, est ce qu'on doit partir de la même quantité d'ARNm pour tous les échantillons ou comme c'est les ARNm d'une seule cellule on peut s'affranchir de ce biais puisque l'on compare les niveaux d'expression d'un gène d'une cellule à une autre ( la variabilité des quantité d'ARNm serait inter-cellules) et bien sur en utilisant un gène de ménage comme référence pour chaque échantillon. Je ne sais pas si j'ai été claire.  [...] A la base si ton gene de menage est vraiment tres solide, tu peux meme te passer de quantifier l'ARN au depart.  [...]

[Biologie Moléculaire] couplage inverse ARNm - protéine ??

Pour confirmer des quantités d'ARNm, une seule solution. comparer avec la production d'ARNm dit de ménage, des ARNm transcrits de manière constante comme l'ARN 16S et reflétant ainsi l'activité de votre cellule. Si votre quantité d'ARNm varie différemment de celle des 16S, cette variation vient bien d'un mécanisme de régulation.  [...] en effet, il s'agit de RT-qPCR. Les extractions/RT/PCR sont faites en même temps pour les deux souches. Vérif ARN en DO = valeurs identique + pureté identique entre les deux souches.  [...]

Quantification d'ADNc après une reverse transcription

-Une dernière chose, un peu tiré par les cheveux, c'est vrai... Quand je fais mon dosage oligreen avec ce kit, la fluorescence de la gamme descend BEAUCOUP plus vite que celle de mes échantillons, est ce normal.  [...] J'ai arrêté de normaliser avec un gène de ménage (ca n'a aucun sens à mon avis). En théorie, le fait de partir d'une quantité d'ARN constante est une normalisation suffisante.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR et quantification relative

Le problème dans la formule que vous m'avez donné (et que je comprends bien car on l'a vu en cours) c'est qu'il faut des E égaux pour le gène en question dans les 2 échantillons, ce qui n'est pas mon cas.  [...] Je ne peux pas faire une courbe moyenne pour le gène d'intérêt, car ils provienne de 2 échantillons différents, et on veut déterminer lequel a la lus forte expression du gène.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

En effet j'ai fait une gamme d'étalonnage (avec différentes dilutions de l'ADN de champignon) qui m'a servie pour ma régression linéaire, j'ai ensuite estimé la Concentration en ADN de champignon des échantillons. Les amorces sont bien spécifiques de la séquence à amplifier et j'ai réaliser 3 répétition de témoin eau.  [...] Dans le cas d'une quantification dite relative où n'est pas utilisée une gamme de cDNA, le calcule des quantités de cDNA peut alors être 2^-Ct si E=2 (une dilution de raison 2 des échantillons est alors réalisée, mais sans connaissance de la concentration de cDNA cible dans ce même échantillon).  [...]