• Forum - Anticorps, Système, Révélation

[Immunologie] western Blot et ELISA

je viens de réaliser un western blot et je n'ai pas obtenu de marquage, mais mes contrôles m'indiquent que le second anticorps et le système de révélation marchent bien. A quoi cela peut être dû.  [...] est ce que l'on peut utiliser la diaminobenzedine comme substrat chromogène afin de révéler la péroxydase en test Elisa sandwich.   [...]

[Immunologie] protocole immuno-histo-chimique

c'est la révélation. ton anticorps secondaire est couplé a une peroxydase, qui transforme le DAB en un produit coloré, donc localisé la ou Ki67 se trouve (d'ou l'intéret d'inactiver les perox. qui trainent un peu partout).  [...] Pour les peroxydases endogènes, ce sont les peroxydases qui sont présentent dans ton tissu avant que tu n'ajoutes ton anticorps couplé à la peroxydase. Ces peroxydases endogènes utiliseraient la DAB exactement comme ton système de révelation et génereraient du bruit de fond.  [...]

[Biologie Moléculaire] Bandes non spécifiques en Western blot

Quel est ton système de révélation car pour moi 1,5 s d'exposition c'est extrêmement court Caméra CCD (pour faire 400 ms, ce doit pas être des hyperfilms. ).  [...] Pour ce qui est de mon système de révélation. membrane PVDF, ECL plus (GE-Healthcare) pendant 3 min, puis je passe ça à l'ettan DIGE imager.  [...]

Sds-page

Donc d'après vous, lors de ma révélation sur membrane avec des anticorps, mes anticorps reconnaissent mes protéines dans leur configuration d'origine (structure III) Je pensais qu'elles restaient sous conformation I.  [...] Oui je sais, on peut aussi utiliser du DTT qui est non hépatotoxique et inodore pour les dénaturer. Mais je me demande pourquoi on utilise du SDS dans le tampon ET dans les gels. Ne pourions nous pas mettre du SDS en plus forte concentration dans le tampon et attribuer la charge du gel de concentration et du gel de migration simplement avec des solutions de Lower buffer et Upper buffer sans SDS (Trizma base + Acide chlorhydrique pour ajuster le pH souhaité).   [...]

Immunologie

J'ai fais de la coloration immunohistochimique indirecte et je n'arrive pas à comprendre le principe de la révélation au DAB. Je sais que le colorant brun se produit après la réaction du DAB avec la peroxydase qui se situe sur l'anticorps secondaire mais ce n'est vraiment pas clair pour moi.  [...] En fait dans la réalité la plupart du temps l'anticorps secondaire est couplé à la biotine et on ajoute par dessus la peroxydase couplée à la streptavidine (la biotine et la streptavidine ont une très forte affinité). Cela permet d'amplifier le signal (plusieurs enzymes par anticorps) et avoir le choix de la technologie de révélation (En changeant la streptavidine mais en utilisant le même secondaire). Pour votre culture personnelle.  [...]

[Biologie Cellulaire] Qui à déjà utilisé le système SNAP i.d. de Millipore pour ses Western Blot?

Une representante de millipore m'a présenté le système SNAP i.d. qui me permettrait de faire le blocage de la membrane, l'incubation avec l'anticorps primaire, les lavages et l'incubation avec l'anticorps secondaires de mes WB en une demi heure... Ce qui est très interessant etant donné que ça me ferait gagner une journée à chaque WB.  [...] Nous l'avons au laboratoire. Et c'est tout aussi miraculeux que cela en à l'air. En une journée tout est fini. Migration, transfert, bloc, anticorps 1er, anticorps 2e, révélation, etc etc... Le résultat sur la table direct.  [...]

[Biologie Cellulaire] Anticorp anti-espece et Western Blot

Dans le western blotting, tu vas effectivement utiliser deux anticorps distincts. L'anticorps dit primaire (que tu as nommé AC1), et l'anticorps qui sera dirigé contre la protéine que tu souhaite mettre en evidence par le western blotting. Cetr anticorps aura été produit par immunisation d'un animal en utilisant la protéine d'intérêt comme antigène.  [...] L'anticorps secondaire (que tu as nommé AC2) est celui qui va te permettre de mettre en évidence la réaction AC1-protéine d'intérêt. cet anticorps (AC2) sera couplé à une molécule qui permettra la révélation (en général l'enzyme HRP, peroxydase de raifort).  [...]

[Biologie Moléculaire] Un anticorps marqué par un fluorochrome peut-il se fixer à un acide nucléique?

Cependant il existe des anticorps capable de reconnaitre non pas les bases natives mais des analogues comme la bromodeoxyuridine.  [...] le contact puce-cible entraine donc l'hybridation de la double hélice d'adn, cela peut être mis en evidence par des techniques optique sous eclairage fluorecent ou par radioactivité. Un systeme de marquage via des traceurs fluorescent ayant été realisé prealablement.  [...]

Plaques ELISA maxisorp, Covalink, Amino ?

en fait j'ai l'impression que quasiment rien ne s'adsorbe au fond de mes puits quand c'est mon anticorps qui est coaté par contre si je coate l'antigène pour le titre de l'anticorps (soit l'anticorps de capture soit le révélation) la ça marche super bien et j'ai meme des faibles concentrations d'antigènes par puits qui sont reconnues (2ng/mL 100µL/puits.  [...] ...) donc je voulais essayer de faire une fixation covalente de mon anticorps au fond de mes puits vu que je suis quasi sure que je lave tout (10µg/mL 100µL/puits... et en dessous ca marche moins bien...).  [...]

[Biologie Moléculaire] immunohistochimie sur rein de souris

Je dois faire une immunohistochimie sur des sections de rein de souris. J'utilise un protocole où je masque avec de l'eau oxygénée la péroxidase endogène puis je bout les sections dans du citrate de sodium pour réveler l'antigène. Je bloque avec de la BSA/PBS dans laquelle j'ai de la streptavidine puis le premier anticorps avec de la biotine dans la solution.  [...] Pour la révèlation j'utilise un second anticorps couplé à l'HRP puis la solution ABC (avidin-biotin complex) et enfin le DAB comme chromophore.  [...]