• Forum - Anticorps, Substrat, Activité

[Immunologie] Question de mon examen d'immunologie

Une autre méthode consiste à faire un western blot des cellules exprimant ton récepteur activé par le PDGF, avec un anticorps dirigé contre une phospho-tyrosine d'un substrat de l'activité kinase du PDGFR. Si tu observes une stimulation du signal entre la condition ou le récepteur n'est pas activé et la condition ou PDGF a été ajouté, c'est que ton récepteur est fonctionnel.  [...] Un biais persisterait, c'est que cette phosphorylation détecté par l'anticorps anti-phospho-tyrosine du substrat pourrait très bien être catalysée par une autre kinase indépendant de la voie du PDGFR. Dans ce cas, tu peux faire le même western blot sauf que tu y ajoutes une condition siRNA COntrol et siRNA PDGFR (enfin là ça commence à devenir très pointilleux tout de même, un essai kinase ou un western blot simple devrait suffire ).  [...]

Lire un test HIV

En effet dans le cas d'une recherche d'antigene, tu utilises un anticorps primaire qui le reconnait, puis tu utilises un anticorps secondaire, qui reconnait ton anticorps primaire. L'anticorps secondaire etant couple a une enzyme qui va reagir avec son substrat et te donner la coloration mesuree par la densite optique.  [...] Comme plusieurs anticorps secondaires se fixent en meme temps sur l'anticorps primaire tu as une amplification du signal, enzyme l'enzyme va degrader plusieurs molecules de substrat (re-amplification du signal).  [...]

Inhibiteur compétitif

Tout comme la liaison du substrat à l'enzyme, la liaison de l'inhibiteur compétitif est réversible. Celui-ci, en se fixant à l'enzyme au niveau du site actif (site liant le substrat) réduit par conséquent son activité par compétition avec le substrat. Toutefois, l'enzyme peut atteindre sa vitesse maximale d'activité enzymatique si l'on augmente la concentration en substrat.  [...] Pour répondre à ta question, l'inhibiteur compétitif inhibe toujours l'activité enzymatique, bien qu'en présence de substrat celle-ci existe toujours (même si parfois très faible).  [...]

spécificité de substrat glucose-oxydase

Je sais que l'enzyme à une spécificité de substrat pour le D-glucose mais comment expliquer la baisse de l'activité pour les autres.  [...] Le D-glucose est le substrat optimal donc si tu utilises autre chose, ça marchera peut-être mais ton site actif ne sera pas utilisé au maximum de ses capacités. sur le plan structural, du D-glucose n'est pas du L-glucose...et si tu utilises un substrat plus ou moins encombrant en terme de masse, ça ne sera pas parfaitement adapté à ton site actif, d'où ta perte d'activité.  [...]

[Biotechnologie] Test immuno-enzymatique... ELISA

On ajoute un deuxième anticorps qui se lie spécifiquement au premier anticorps. Le deuxième anticorps est marqué par un produit fluorescent, une espèce radioactive,... On peut aussi lui attacher une enzyme qui transforme un substrat (la molécule qu'on lui donne) en un produit détectable.  [...] On met en évidence l'anticorps marqué. Si on le détecte, la protéine est présente. Sinon, elle ne l'est pas. Dans le cas où on a attaché une enzyme au deuxième anticorps, on ajoute le substrat pour voir si la réaction se fait, et ainsi vérifier que l'enzyme est présente.  [...]

[Biochimie] Quantifier un western blot

le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle. C'est pour cela que l'idéal est d'avoir une gamme de quantité sur le même gel, et sur la même expo de la même protéine, pour t'assurer que tes conditions sont bien quantitatives.  [...] le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle. -. Je suis en effet tombé dans le panneau, certains de mes puits étant largement surchargés.  [...]

[Biochimie] Expérience!!!!!

tu mesure son activite pour son substrat a sa temperature optimal. puis tu chauffe a 50°C et tu l'as remet a sa temperature et tu mesure son activite avec son substrat. si l'enzyme est detruite alors il n'yaura une faible activite et si ce n'est pas le cas, elle aura une activite normal.  [...] Entièrement d'accord. D'autant plus qu'il me semble que l'expérience avec l'amylase est au programme de seconde.   [...]

Méthode ELISPOT !

avec un elispot, tu peux compter le nombre de cellules qui sécrètent un facteur donné (IFNg par exemple). En gros, tu actives tes cellules puis tu les déposes dans un puit coaté avec des anticorps dirigés contre l'IFNg. Ensuite tu révèles l'IFNg par une méthode Elisa utilisant un substrat insoluble qui va précipiter et te donner des taches colorées ou immunospots. Un spot=une cellule sécrétrice.  [...] pour la chromato, je pensais à fixer muc1 sur des billes de sépharose et incuber avec du lysat cellulaire. Ensuite, tu passes l'éluat sur western. Tu peux colorer la membrane au rouge ponceau pour avoir une idée de la taille des protéines récupérées puis, en fonction des différentes possbilités, tester les anticorps.  [...]

[Biochimie] enzymes et substrat biolux

la GFP c'est encore autre chose. Elle n'a pas d'activité enzymatique contrairement a la ßgal ou luciferase. C'est simplement une protéine fluorescente, c'est à dire qu'elle émet des photons lorsqu'on l'excite a une longueur d'onde particulière. Elle n'utilise pas de substrat au sens chimique.  [...] Il m'est arrivé de mesurer l'activité beta-galactosidase avec un luminomètre. Dans ce cas là, le substrat employé ne doit pas être du X-Gal comme il est coutume d'employer pour des tests de sous-clonage, mais un substrat luminescent.  [...]

Test ELISA

Est-ce que tu as fait des contrôles du style. anticorps I, anticorps II, substrat (sans antigène pour vérifier si tes Ac I et II ne se fixent pas sur autre chose que ton antigène donc s'ils sont vraiment spécifique de ton antigène) / anticorps II, antigène, substrat (sans Ac I pour vérifier si ton Ac II ne se fixe pas directement sur ton antigène ou à une autre protéine) / substrat (voir s'il s'oxyde spontanément).  [...] En tout cas si c'est un kit acheté dans le commerce et non un truc développé maison, normalement il y a pas de souci niveau réactivité des anticorps.  [...]