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[Biochimie] Immunodiffusion

De plus, on a besoin de plus d'informations pour te répondre (ou peut-être que c'est juste moi qui en ai besoin, mes cours sur l'immunoprécipitation remontent à... longtemps...). Est-ce que tu es bien dans le cas d'une manip où tu as ton anticorps dans le gel et tu cherches à quantifier la BSA dans un échantillon inconnu en comparant cet échantillon avec plusieurs puits/disques étalons comme expliqué ici sur la 3ième diapo.  [...] Si oui, j'imagine que ça marche mieux avec un anticorps (Ac) polyclonal car ce dernier est en fait une soupe contenant des anticorps dirigés contre les différents épitopes de ton antigène (Ag, soit, ici, la BSA). Une même molécule de BSA va donc pouvoir fixer plusieurs molécules d'anticorps, ce qui formera un gros complexe antigène-anticorpS (1Ag-plusieursAc).  [...]

[Biochimie] Caractéristiques des tampons utilisés en ELISA

Après l'étape de saturation du puits, on ajoute l'anticorps secondaire portant un marqueur de révélation. On ajoute également du Tween 20 et de la BSA dans le tampon véronal où celui ci est dilué.  [...] Le Tween 20 est un détergent qu'on utilise généralement pour limiter les fixations non spécifiques. Seulement voila, dans une série de manip', j'ai dilué mon anticorps secondaire dans du tampon véronal pur (càd sans BSA, ni tween). A ma grande surprise, je n'ai eu AUCUN signal dans tous les cas (donc, aucune fixation de mon anticorps secondaire Pourquoi ).  [...]

Comment gérer cette situation en stage?

Bon après je commence le stage, c'était le 5 janvier. Le premier jour était assez intéressant, j'ai redécouvert comment faire un elisa, avec un kit contenant les anticorps que je devais diluer, les mettre à adsorber sur les puits, j'ai aussi fait de la culture cellulaire (un passage de cellules classiques) et ma responsable m'a aussi montré comment filtrer du BSA pour faire un tampon pour de la chromatographie.  [...] Puis j'ai fait de la biblio toute l'aprem. Le lendemain les anticorps étaient sur la plaque donc elle m'a montré comment faire les étapes de l'elisa. Le lendemain j'ai mis à coater une plaque moi même et j'ai fait un elisa sur cette plaque le jour d'après.  [...]

[Biochimie] Principe et manipulations générales pour le test ELISA indirect

Premièrement, j'ajoute que nous avons 2 types d'anticorps, Goat profilin polyclonal antibody et rabbit anti-goat IgG alkaline phosphatase conjugated, le tampon de lavage est du PBST et celui pour sceller les puits (to block) est du 5% BSA dans du TBST et le substrat du pNPP.  [...] Vous ne connaissez pas votre concentration d'antigène (Ag) puisque vous en faites justement le dosage donc il vous faut trouver la concentration d'anticorps (Ac) pour laquelle vous ne serez pas en excès d'Ag ce qui pourrait empêcher la lecture du signal par effet dit crochet ou de zone correspondant à un même signal pour deux concentrations différentes.  [...]

[Biochimie] Bsa

Si c'est pour faire un dosage par ELISA par exemple, la BSA sert à saturer les sites non occupés par la protéine à doser. Ca évite que les anticorps se fixent de manière non spécifique sur les parois du puits.  [...] Immunochimiluminescence est un terme qu'on utilise pas très souvent (souvent pour faire joli ^^). Lorsqu'on fait un western blot ou un ELISA en utilisant des anticorps couplés à la peroxydase, c'est de l'immunochimiluminescence. Immuno parce qu'on utilise des anticorps, et chimiluminescence parce que l'anticorps est couplé à une enzyme (généralement une peroxydase) qui va transformer son substrat en une molécule qui va produire de la lumière.  [...]

[Immunologie] Elisa: Help pour blocage du non spé dosage d'anticorps

Je suis en train de mettre au point un dosage d'anticorps par technique elisa. J'utilise des peptides (trentaine d'AA) qui sont biotinylés et coatés sur des plaques streptavidine (Pierce) qui sont prébloquées au superblock. Le coating se fait par incubation d'1h des peptides biotinylés (dilués en PBS) dans les puits des plaques revêtus de streptavidine.  [...] Peut être que la BSA est trop grosse pour saturer des puits coatés avec des peptides d'une trentaine d'AA et du coup gêne la reconnaissance des peptides par les anticorps du sérum.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot et interférences?

J'ai un problème. mon échantillon protéique contient 10mg d'albumine bovine par ml... Cette albumine laisse une grosse tache sur mes blots (à 68 kD) et une des sous unités de la PDH est à 74 kD, et donc je ne sais pas si mes sérums sont positifs pour la PDH ou pour l'albumine.  [...] Peut etre que, tout en augmentant la résolution, tu pourrais tester en parrallèle un anticorps anti bsa pour etre sur que la bande que tu observes comigre bien avec ce que tu penses etre de la bsa. Je vais peut etre dire des bétises mais si tu utilises des sérums bovins (à moins que ce soit autre chose) tu auras donc des anticorps bovins anti bsa mais si ton anticorps primaire anti PDH n'est pas d'origine bovine (en général, c'est souris, lapin ou chévre), tu réveleras avec un anticorps secondaire (souris, lapin ou chévre) qui ne reconnaitra pas les anticorps anti bsa d'origine bovine. A moins que tu révele ta protéine différemment.  [...]

[Biochimie] Mise au point ELISA qui pose probleme

Je suis parti sur ELISA par compétition, en coatant le peptide recombinant sur une plaque polysorp, puis en saturant avec du PBST BSA 3%. La compétition se fait avec échantillons et anticorps dilués dans PBST BSA 1%. Je dilue ma.  [...] gamme dans du PBST BSA 1%. A chaque tentative, j'ai toujours obtenu une belle gamme. En revanche pour les échantillons, je n'ai aucun réplicat correct et je ne retrouve aucune logique dans les échantillons dilués en série.  [...]

[Biochimie] Dosage de protéines par Bradford

J'ai effectué le dosage de protéine du lait. Pour l'extraction des protéines, j'ai peser 4g de l'échantillon et ajouter 20 mL de méthanol. Après centrifugation le volume extrait de surnageant est de 21 mL avec une absorbance de 0.050 nm. La courbe d'étalonnage du BSA en fonction de l'absorbance est. y= 0.0078x.  [...] Non, je répète. vous aviez 4 g d'échantillon dans vos 21 mL, au final vous avez 6.4 µg protéine BSA dans 100µL qui représente 0,019 g donc.  [...]

[Biologie Cellulaire] isolation des mitochondries

Le Mitotracker nécessite une optimisation de sa concentration car il a tendance à marquer aussi d'autres structures cellulaires, donc un risque de fausse interprétation. Un marqueur de la mitochondrie beaucoup plus spécifique et permettant une localisation des mitochondries plus résolue est un marquage anti-Hsp60.   [...] Le marquage anti-Hsp60 se fait par immunofluorescence. Dans mon protocole, j'utilises un anticorps monoclonal anti-Hsp60 (Santa Cruz Biotechnology). Le protocole non détaillé.  [...]