• Forum - Amplification, Température, Fusion

[Biologie Moléculaire] Courbes PCR en temps réel

Pour s'assurer de la spécificité de l'amplification, on réalise a la fin des cycles d'amplification une rampe de température qui permet de déterminer le point de fusion des produits formés. Pour cela, on fait passer la température de 55 à 85° par petits intervalles tout en mesurant la fluorescence.  [...] Au fait, je viens de lire de ton message un peu en retard car j'ai passé mon exposé cette aprémidi, n'empeche que pour la courbe de fusion, j'ai pas dit tout ce detail, enfin juste que que le fai que tous les échantillons presentent le meme pic de température donc c'est bien le gène recherché avec quelques définitions, de courbe de fusion et Tm, pour le premier graphe je l'ai analysé de la même manière que toi avec plus de détail.  [...]

[Biologie Moléculaire] QPCR, courbe Tm?

Pourrais tu mettre l'appercu d'écran des courbes de fusions, car en fait, un dimere de primer a souvent une température de fusion plus basse que le produit spécifique, ce qui se traduit par 2 pics distincts si les Tm sont différents (au fait, quelle est la taille attendue du produit d'amplification spécifique).  [...] As tu vérifié que rien n'a été modifié dans le programme du Lightcycler concernant le nombre de cycles de PCR, l'étape de fusion (en particulier la vitesse de variation de température en °/s ou le nombre d'acquisition par seconde (sur LC480)) par rapport aux manips où les courbes de fusion étaient OK.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

Ca se voit très bien sur une courbe de fusion, là j'ai 2 pics bien distincts, celui des dimers, et celui de mon amplification. Et je choisis donc de faire la mesure de fluorescence dans une zone de température où les dimers seront dissociés.  [...] L'augmentation de la température au moment de la prise de fluorescence est une manière d'éliminer la fluorescence due au dimer de primer. On trouve cette technique dans les recommandations technique du lightcycler il me semble. Perso sur mes couples avec dimer de primer, des fois ca marchait, et des fois pas, ou plutot, quand j'augmentais le t° au dela du Tm des primers pour la prise de fluorescence, il arrivait que mes primers n'amplifient plus avec une bonne efficacité, alors qu'à température plus basse cela allait.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rt-lamp

En revanche, certains parlent de diagnostic par RT-LAMP. Je ne connais pas cette méthode, et la recherche sur google n'a rien donné.   [...] Isothermal Amplification) est une RT PCR avec 6 primers qui permet une amplification plus rapide car à température constante. Tu génères des ADNc en boucle grâce aux différents primers. C'est assez compliqué à expliquer mais suis le lien ci-dessous pour une explication avec des schémas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Ton protocole n'est pas bon, dénaturation trop longue et gamme de température d'hybridation trop vague. Généraliser est difficile car les protocoles de PCR dépendent de ce qu'on veut amplifier, de l'enzyme utilisée pour la polymérisation, et du Tm des primers.  [...] je crain qu'il n'ai eu conffusion je ne cherche pas à amplifier l'histone H2B mais je cherche à amplifier le gene H-2b de la souris C57BL/6 ( qui est l'équivalent du systeme HLA chez l'homme ) et j'ai fais exactement ce que vous m'avez dit mais ça ne marche pas du tout. pouvez vous essayer de votre côté.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR maîtrise de la Tm

De plus il dit qu'il ya moins de 5°C de différence de Tm entre les 2 amorces. C'est pas plutôt 5°C de différence entre la température de fusion de l'amorce et celle de l'ADN à amplifier.  [...] Si la température d'hybridation est appropriée pour une amorce mais pas pour l'autre, tu n'auras pas d'amplification du fragment voulu.  [...]

SYBR green et BET (ou la non compréhension de la PCR en temps réel)

Dans la PCR classique, le BET n'est ajouté que lors du gel (directement dans le gel ou via un bain contenant du BET), il s'intercale dans les molecules d'ADN et fluoresce sous UV. Il permet une semi quantification car en général on revele en fin de reaction donc il s'agit d'une quantité finale.   [...] La différence est que la PCR en soi n'est qu'une technique amplifiant une section d'ADN, il faut ensuite pouvoir l'identifier le plus souvent en faisant une migration sur gel d'agarose coloré au BET (et encore, on peut très bien se servir du Sybr Green). A la fin de la PCR Temps Réel, on a les courbes d'amplification et de fusion Melt Curve, qui permet de vérifier que l'amplification est bien du bon fragment, donc on gagne du temps et du matériel.  [...]

problème d'analyse de gel de migration

comment jouerai la temperature si c'etait sur l'appariement des deux amorces. dans ce cas on aurai pas d'amplification et donc pas de bandes, et encore moins de bandes multiples.  [...] Mais si tu utilises une température trop basse, tu peux amplifier des séquences avec erreur, il suffit qu'une des deux amorces se fixe un peu plus loin et hop.  [...]

bandes non spécifiques

j'ai fait une PCR pour amplifier les microsatellites. mais sur le gel mon encadreur m'a dit qu'il ya des bandes noin spécifiques. s'il vous plait qu'est ce que ce la veut dire.   [...] c'est des produits de PCR qui ne sont pas issus de l'amplification de ta cible, par exemple si la température d'hybridation est trop basse par rapport au Tm des amorces.  [...]

[Biologie Cellulaire] Point de contrôle mitotique

Et cette aneuploïdie n'est pas causée que par un point de contrôle mitotique défectueux. Elle peut passer aussi par une amplification centrosomale, par des recombinaisons homologues aberrantes, par des cassures chromosomiques, par des amplification de zones chromosomiques souvent contenant des oncogènes (double minutes), par la fusion de ces doubles minutes (Homologous Stained Region.  [...] Troisième alternative. l'amplification centrosomale. Une cellule ayant 3 ou 4 centrosomes par exemple pourra les répartir de manière aléatoire dans la cellule. Au cours de la mitose, chaque centrosome peut tirer son lot de chromosomes de son côté, chacun emportant avec lui un nombre, lui aussi aléatoire de chromosomes.  [...]