• Forum - Amplification, Plasmide, Extraction, ADN

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.  [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.   [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...] Les essais ont révélés que la DNase du kit Machery Nagel ne fonctionnait pas assez sur colonne (amplification en PCR du plasmide ajouté pendant l'extraction d'ARN). Dans la notice de cette DNase il est précisé qu'en cas de grosse quantité d'ADN, il faut utiliser la DNase après colonne puis réaliser un clean up.  [...]

Calcul de réactif limitant d'une PCR classique

Je dois trouver quel est le reactif limitant pour ma PCR et determiner le nombre de cycle que je peux faire. Voici les données que j'ai.   [...] ADN de plasmide introduit au temps initial. 1ng sachant que le plasmide fait 6.4Kpb et que l'amplification se fera sur 1Kpb.  [...]

[Biotechnologie] temps pour les différentes étapes séquençages

c'est à dire extraction ADN, amplification, construction des banques et le controle qualité.  [...] j'aimerai également savoir le temps générale qu'il faut pour aller de la construction des librairies au traitement des données.   [...]

[Biologie Moléculaire] ARN contaminé par de l'ADNgénomique

Je viens de rechercher sur le net des explications sur la contamination ADN que j'obtiens en réalisant mes extractions ARN et je suis tombée sur le forum de futura science où en janvier 2003 yoyo indiquait qu'il y a certaines taq qui peuvent reverse transcrire de l'ARN.  [...] J'ai réalisé un traitement DNase de mes ARN lors de l'extraction ARN mais lorsque j'essaie d'amplifier mes ADNc avec des primers se trouvant dans le promoteur de mon plasmide ou à l'extérieur de mon ORF (après le teminateur et dans le promoteur), je sort toujours quelque chose, or je ne devrait pas puisque je recherche des ARNm (RT avec oligodT) qui, si mes souvenirs sont les bons, correspondent uniquement à l'ORF (ATG au STOP).  [...]

rDNA ou rRNA?

L'amplification a partir du rDNA me semble avoir plus d'avantage qu'a partir du rRNA. L'ADN est plus stable, moins degradés, ensuite il n'y a pas de RT necessaire, une etape en moins, sans parler de l'extraction d'ADN qui est souvent plus facile a faire.  [...] Sinon pour l'extraction, par exemple pour un profiling de bacteries, lorsque tu veux determiner quelles especes sont presentes a tel endroit, en fait tu extrais l'ADN total de tes bacteries, et apres tu fais une PCR (amplification de l'ADN) avec des amorces universelles des 16S des bacteries.  [...]

cellules competentes

est ce que quelque un aurait des informations sur les cellules beta compétente de e coli.   [...] On dit que des bactéries sont compétentes lorsqu'elles présentent des trous dans leur membrane qui leur permet d'intégrer de l'ADN exogène. Ces bactéries sont notamment utilisées dans le contexte de transformation bactérienne, c'est-à-dire de l'introduction d'ADN (souvent sous la forme de plasmide), pour l'amplification de ce plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Produit PCR / microsatellites

Je suis actuellement en train de travailler sur l'amplification de régions mitochondriales à partir d'ADN dégradé (extraction sur des os) et j'ai un problème en PCR. Quand j'ai testé mes primers en gel d'aggarose après amplification j'obtenais des bandes, certes pas très marquées mais tout de même visibles.  [...] Autre question, j'essaie d'amplifier ces régions avce pour objectif de faire de la génétique de populations d'un poisson. Je commence donc à designer des primers sur des régions nucléaires, mais mon superviseur m'a demandé d'éviter tout microsatellite et je ne comprends pas pourquoi.   [...]

aide pour un protocole (PCR, DGGE...)

Pr des precisions. fo juste que je trouve des bacteries qui exploitent le black carbone et je ferai de l extraction d adn, pcr amplification, DGGE.  [...] Je commencerai d abord par l extraction d adn de terre puis les bacteries et j aimerais savoir ce que chaque etape apportera ds ma recherche et ce qui me permettra a la fin de dire tiens cette bacterie a exploité le black carbon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Explications rapides sur la PCR

C'est LA base de la PCR, l'ADN polymerase a besoin d'une amorce pour commencer la réplication de l'ADN. L'idée de génie est de créer cette amorce pour amplifier un morceau d'ADN souhaitée. Comme il y a deux brins sur une molécule d'ADN, il en faut deux.  [...] Enfin, quelqu'un peut-il me faire un petit résumé rapide des avantages / inconvénients / spécificité de ces deux méthodes ( amplification par plasmide, et amplification par PCR ).  [...]