• Forum - Amplification, Culture, Bactéries, Plasmide

[Biologie Moléculaire] amplification: PCR vs plasmides

Quels sont les différents avantages/inconvénients de la PCR et de l'amplification par culture d'E.Coli contenant un plasmide de notre fragment.  [...] Comme l'a précisé Piwi, une amplification par PCR est moins fidèle qu'une amplification par culture bactérienne, à moins d'utiliser des enzymes High Fidelity (Pfu, KOD, Herculase...) qui généralement coûtent au final plus cher en amplification et séquençages que le matériel et le temps nécessaires pour faire une culture de bactéries et une prep de plasmide.  [...]

isolation d'un plasmide

Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation et l'amplification ne possédent pas de plasmides... pour t'en rendre compte, fait, à partir d'une colonie, une culture de bactéries non transformées d'une part et transformées d'autre part... fait ensuite une miniprep d'ADN plasmidique.  [...] .. tu verras que tu as du DNA dans le clone transformé et que tu n'en as pas chez le non transformé... si ce n'est pas le cas, c'est que tu as transformé des bactéries qui ont déjà un plasmide... ce qui ne devrait pas être le cas dans la majorité des utilsations faites en biomol.  [...]

PCR (amplification génique)

Souvent en biologie on est limité par la quantité de matériel biologique. La PCR est donc une méthode géniale et puissante puisque l'amplification est exponentielle. En plus les cycles de PCR sont relativement courts (environ 3 minutes il me semble) ce qui fait gagner beaucoup de temps par rapport à une amplification sur culture de bactéries transformées (beaucoup moins d'étapes aussi).  [...] En plus de ça, si tu as un long fragment et que tu as une région d'intérêt à l'intérieur, grace à l'encadrement de la région par les amorces de PCR, tu peux choisir avec précision ton fragment d'intérêt. Bref, je vais pas rentrer dans les détails tellement les applications de la PCR sont nombreuses.   [...]

[Biologie Moléculaire] Explications rapides sur la PCR

Classiquement, Thermus aquaticus, bactérie des grand fonds. les températures de la PCR sont comprises entre 50 et 95°C. Or à ces températures, les protéines sont souvent sans structures tertiaires donc sans activité. Comme cette bactérie vit près des sources chaudes, ces protéines résistent très bien à ces températures.  [...] Enfin, quelqu'un peut-il me faire un petit résumé rapide des avantages / inconvénients / spécificité de ces deux méthodes ( amplification par plasmide, et amplification par PCR ).  [...]

Calcul de réactif limitant d'une PCR classique

ADN de plasmide introduit au temps initial. 1ng sachant que le plasmide fait 6.4Kpb et que l'amplification se fera sur 1Kpb.  [...] dNTP. 2.5 mM chaque base on en met 4microL qu'est ce qui est limitant dans ma PCR faire les calculs puis determiner le nombre de cycles par cette formule. N = No * 2^x ==. N/No = 2^x ==. log (N/No) = xlog2.   [...]

[Biologie Moléculaire] Deux bandes en PCR

Maintenant vous avez une énorme amplification (vous avez mis combien de plasmide Remarquez, j'en ai une petite idée ) Dans ces cas là on parfois des dédoublements de bande ou l'impression que la bande est plus haute ou plus basse qu'attendu. A mon avis vous pouvez refaire votre PCR avec 10x moins de plasmides (parce que là vous en avez pas mal quand même) et vous n'aurez plus qu'une bande à la bonne taille.  [...] Sinon pour la bande supérieure je pensait que c'est le plasmide (donc non amplifié) mais je ne sais pas si c'est détectable sans amplification avec les quantités que l'on a utilisé.(pareil le manque d'expérience) sinon je n'ai pas d'autres idées.  [...]

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.  [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.   [...]

amplification de phages

Je me demandais pourquoi l'amplification du phage doit se faire dans des conditions où les bactéries sont en phase exponentielle de croissance.  [...] Lors de cette amplification du phage, nous ajoutons 100µl de CaCL2 + 100µl de solution de stock de phage à 5ml de bactéries. Puis on met sous agitation à 37°C pendant 24h.  [...]

[Biologie Cellulaire] gros besoin d'aide: toutes mes cellules C2C12 sont mortes!

Je viens de redémarrer un labo de culture cellulaire, et lundi, j'ai ensemencé mes premières cellules pour amplification.  [...] J'ai du mal à comprendre qu'on te laisse gérer tout cela toute seule. La culture cellulaire ne s'improvise pas et il faut bénéficier d'un bon encadrement lorsqu'on débute de nouvelles méthodologies appliquées à la culture cellulaire, surtout pour la congélation/décongélation de cellules.  [...]

Vecteur de clonage, PCR et vecteur d'expression

Voilà, peux t-on faire une PCR sur un vecteur de clonage comportant le gène d'intérêt c'est pour le clonage d'une enzyme. Ils parlent de strands (anglais) de plasmides qui ont été amplifiés par PCR dans un premier temps mais je ne sais pas si c'est possible directement sur un vecteur de clonage Le gène d'intérêt est lié au gène GST (gluthation transférase).  [...] C'est assez simple en fait. Le gene d'interet etait deja present sur un plasmide mais qui ne leur convenait pas. Ils ont donc amplifié le gene par PCR, on purifier le produit d'amplification sur gel pour se debarasser du plasmid ayant servi de matrice, pour cloner le tout dans un plasmide permettant l'expression de la protéine.  [...]