• Forum - Amplification, ADN, Bactérie

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Après extraction de mes bandes d'ADN obtenu sur gel, j'ai réalisée une purification avec le kit nucléoSpin Extract II de Macherey Nagel. Ensuite j'ai vérifiée sur gel que je n'avais pas perdu trop en quantité d'ADN pour la ligation. J'ai donc effectué la ligation sur vecteur de clonage pGEMT-easy de Promega en laissant une nuit à 4°C puis T°ambiante.  [...] J'ai travaillé sur E.coli DH5a, et je me souviens que si par miracle elle poussait après ligation+transformation, après une amplification, j'avais de très faible quantité d'ADN. Donc la bactérie est peut être aussi pourrite pour ce genre de chose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

1/ Tu es encore contaminé par de l'ADN, ce qui explique l'amplification après un traitement RNAse (mais sans traitement DNAse).  [...] Je ne pense pas que digérér par DpnI après l'amplification soit utile dans la mesure ou il s'agit d'une RT PCR, possiblement contaminée par de l'ADN génomique, et non de l'amplification d'un ADN venant d'une bactérie. Ceci dit, si tu soupçonnes un problème de DNAse, tu peux prédigérer tes échantillons par une enzyme de restriction (avant de faire la PCR).  [...]

PCR et vecteur de clonage

Les vecteurs de clonage permettent d'obtenir un vecteur (plasmide, phagemide, cosmide etc...) quand on parle d'amplification de l'ADN, c'est alors que tu as une molécule qui va se répliquer dans la bacterie (comme les chromosomes) ceci va permettre d'obtenir un grand nombre de copie du plasmide.  [...] Donc il doit etre possible de calculer l'amplification en aprtant du postulat (faux) qu'une seule molecule transforme une bacterie. tu connais le nombre de plasmide par cellule, et le nombre de cellules dans une culture de 5ml alors cela te donne un nombre de molecules.  [...]

[Biologie Moléculaire] les enzymes

Cette enzyme, une ADN-polymérase d'origine bactérienne a en effet permis l'élaboration d'une technique révolutionnaire d'amplification de l'ADN. La PCR(réaction de polymérisation en chaîne.).  [...] Bon la taq fonctione a de hautes temperatures pendant un certain temp ce qui la rend utile pour un clonage d'adn avec moins d'inconveignants et elle vien d'une bacterie vvant dans des milieu a haute tempeature.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème d'amplification de gènes bactériens

Dans mes travaux je dois amplifier des genes d'interets du genomes de plusieurs bacteries. Mais je n'arrive pas a amplifier ces genes, des bacteries individuellement. Mais lorsque je met ensemble tous les ADN de mes bacteries j'ai des amplification apres PCR.  [...] Les causes peuvent être nombreuses...Qu'avez-vous essayé de faire pour résoudre ce problème Quelle différence y a-t-il au niveau du protocole entre l'amplification avec un seul type d'ADN bactérien et plusieurs types d'ADN bactériens, hormis la quantité d'espèces d'ADN bactérien différent dans le mélange bien entendu Mettez-vous plus d'ADN dans un cas que dans l'autre.  [...]

rDNA ou rRNA?

Sinon pour l'extraction, par exemple pour un profiling de bacteries, lorsque tu veux determiner quelles especes sont presentes a tel endroit, en fait tu extrais l'ADN total de tes bacteries, et apres tu fais une PCR (amplification de l'ADN) avec des amorces universelles des 16S des bacteries.  [...] En gros, si tu as une ou 10^9 cellules d'un certain type, tu n'obtiendras qu'un seul profil en amplifiant l'ADN. Par contre en travaillant à partir d'ARN (proportionnel au nombre de cellules en activité) et en combinant celà avec un système de quantification de l'amplification (voir le mot clé.  [...]

la taq polymérase????

En 1990 1 enzyme appelée taq-polymérase fut élue molécule de l'année.Cette enzyme, une ADN-polymérase d'origine bactérienne a en effet permis l'élaboration d'une technique révolutionnaire d'amplification de l'ADN. La PCR(réaction de polymérisation en chaîne.).  [...] cette méthode, la PCR est également appelée amplification de fragment d'ADN, car elle permet d'obtenir après plusieurs cycles à température variablement hautes, à cause de dénaturation succééssives, un grand nombre de fragments identiques à celui de départ, ce qui revient au résultat d'un clonage avec moins d'inconvénients.  [...]

aide pour un protocole (PCR, DGGE...)

Pr des precisions. fo juste que je trouve des bacteries qui exploitent le black carbone et je ferai de l extraction d adn, pcr amplification, DGGE.  [...] Le milieu a donc été modifié chimiquement et tu analyse ces modifications. Quand aux bactéries il est important de démontrer qu'elles sont impliquées dans les modifications chimiques que l'on a observé. Comme ces bactéries ont été caractérisées, on connaît leur profil electrophorétique sur gel dénaturant.  [...]

cellules competentes

est ce que quelque un aurait des informations sur les cellules beta compétente de e coli.   [...] On dit que des bactéries sont compétentes lorsqu'elles présentent des trous dans leur membrane qui leur permet d'intégrer de l'ADN exogène. Ces bactéries sont notamment utilisées dans le contexte de transformation bactérienne, c'est-à-dire de l'introduction d'ADN (souvent sous la forme de plasmide), pour l'amplification de ce plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Connaissez -vous un outil d'analyse d'affinité d'un primer pour une séquence ?

Bien, (rappelez-vous que ma molécule d'ADN est simple brin) je travaille actuellement à une expérience d'amplification par cercle roulant (rolling-circle amplification, RCA).  [...] Mais j'obtiens bien un produit de RCA (observé contre un controle sans molécule template d'ADN = aucune amplification) avec l'une ou l'autre amorce alors que sans le Forward primer, la réaction n'est pas censée se produire avec le Reverse primer seul.  [...]