• Forum - Amorces, Site, Restriction

[Biochimie] Tag His en N Ter???

Tu veux dire que lors de la PCR au cours de laquelle j'introduis mes sites de restriction spécifiques, je design les amorces de telle sorte qu'elle contienne à la fois le tag his et le site de restriction d'un côté et de l'autre le site de restriction suivi du codon stop.  [...] Tu peux synthetiser des amorces jusqu'a 100 pb. Au dela de 60/70 pb par contre, il faut demander une purif PAGE pour etre sur que tu ais tes amorces de la taille voulue.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR?

Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction.  [...] ok, alros pour mes amorces 3 et 4 il faut que je fasse attention a chevaucher un site de restriction de preference a bouts francs pour une fois mon doublet final obtenu pouvoir le remettre dans mon plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

As tu des nucléotides libres de chaque côté de ton site de restriction Ou as tu dessiné ton amorce en rajoutant le site de restriction.  [...] Le produit PCR est effectué à l'aide d'amorces dont le site de restriction a été rajouté avec 3 nucléotides en amont. Celui-ci a été purifié à l'aide d'un kit de purification de produit PCR sans passer par une extraction sur gel car j'ai un produit bien spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Voilà, je n'ai pas compris la correction d'un TD à propos de la PCR. Par le fait que l'on utilise des amorces oligonucléotidiques de synthèse, il est possible d'ajouter des séquences dans la région 5' de chaque amorce. Par exemple, un site de restriction aux 2 extrémités du fragment d'ADN synthétisé permettrons ultérieurement d'assembler le produit PCR dans un plasmide.  [...] Mais d'aprés ce que j'ai compris, c'est sur cette partie de l'amorce en trop ou qui ne s'hybride pas qu'on insère un site de restriction. Donc à cet endroit là, comment l'enzyme de restriction va t'elle couper si elle ne peut le faire que sur une région double brin et que le site de restriction correspond justement à une zone non hybridée ou simple brin.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

tu veux les mettre dans un ordre précis La meilleure solution je pense est d'utiliser des amorces contenant des sites de restriction et de faire une ligation ensuite.  [...] La methode que tu as decrite est la meilleure pour ce genre de truc. Utiliser des sites de restriction va compliquer la chose. Es tu sur d'avoir bien purifie tes premiers produits PCR histoire de ne pas ramener des amorces dans ton 2eme tours de PCR.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Pour introduire des amorces avec des sites de restriction en phase il faut rajouter deux nucléotides avant le site BamHI et deux nucléotides après le site de SalI ça sera comme suit.  [...]

Proteine de Fusion Besoin d'aide

j'ai donc utilisé les enzymes de restriction coupant au niveau du sites EcoRI de pGEX. afin d'inserer mon gène EGFP qui possède dans sa partie MCS, un site de restriction EcoRI egalement. mais je ne sais pas comment couper, apres le gène EGFP pour qu'il soit complementaire de la sequence de l'extremité colante correspondante sur pGEX.  [...] doit on utiliser les amorces ou doit ont couper tout simplement pEGFP-N1 a Not 1 ou XBA1 situé quelque nucleotide apres EGFP. sachant que il existe un site de restriction Not1 sur pGEX-4T-2.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment design des amorces PCR..

Bah oui justement le site de restriction je dois le mettre au début de mes amorces pour pouvoir l'insérer ensuite dans le plasmide de la bactérie digérée par BamH1 et Sma1. Mais je sais pas s'il faut compter les nucléotides (qui font donc partie de l'amorce.  [...] Et en fait ouais je m'étais emmêlé les pinceaux avec les sites de restriction, sur ma fiche ils étaient ecrits à l'envers, donc j'ai fait n'importe quoi en faisant les premières amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]