• Forum - Amorces, Séquence, Classique

[Biologie Moléculaire] inverse PCR

L'inverse PCR est utilisée pour amplifier l'ADN avec une seule séquence connue... Et oui car pour une PCR classique tu as besoin de 2 amorces.  [...] Et on utilise pas de plasmide... Ce que tu peux confondre avec un plasmide n'est qu'une séquence d'ADN génomique qui s'est refermée sur elle-même... (une des étapes de l'inverse PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] Design de sonde Taqman à partir d'une sonde FISH

Quoi qu'il arrive il te faut des amorces de part et d'autre de la sonde pour la qPCR. Réutiliser la séquence de la sonde FISH pour une qPCR en Taqman, c'est une bonne idée, d'autant qu'elle est publiée. Donc oui il te faut faire un blast et aligner les séquences spp.  [...] mais uniquement pour designer les amorces vu que tu as ta séquence pour la sonde taqman. Ensuite, pour une PCR classique, tu reprends les amorces de ta qPCR et c'est parti.  [...]

phages et S&V

Si on regarde ce qu'a séquencé Venter dans la mer des Sargasses la diversité des phages est assez faible. Il s'agis essentiellement d'un seul groupe de phage de cyanobactérie (qui est connu, car très abondant). J'ai eu le loisir de faire le même type d'étude mais avec une approche plus classique avec des amorces PCR (un peu comme on fait avec l'ARN16S des bactéries).  [...] Avec cette approche on détecte une bien plus grande diversité de phages parceque les amorces n'amplifie pas forcément l'ADN le plus abondant mais aussi celui qui colle le mieux avec la séquence des amorces. Les 2 approches sont toutefois complèmentaires car l'approche PCR ne cible qu'un seul gene et ne couvre pas la diversité du contenu en gène.  [...]

Séquençage de l'ADN

Ah, si on ne connait rien de la séquence, c'est différent. On peut par exemple la cloner dans un vecteur connu et l'utiliser comme matrice de séquençage, mais on peut aussi utiliser des amorces aléatoires. Qu'il y ait un overlap n'est pas un problème si on a suffisamment de lecture. Renseigne toi sur le shotgun sequencing.  [...] Contrairement a la PCR classique, qui utilise un couple d'amorces (qui du coup borne la zone amplifiée), on n'utilise qu'une seule amorce en séquençage. Du coup, à chaque cycle, l'amplification démarre depuis cette amorce et sur un seul des deux brins, il peut y avoir n'importe quel autre ADN qui traine, il ne sera pas amplifié tant qu'il ne comporte pas la séquence de l'amorce.  [...]

[Biologie Moléculaire] Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq

On peut utiliser des amorces dégénérées pour une PCR classique quand on ne connait pas sa séquence (puisque le but est juste d'avoir une bande), mais pour de la qPCR il vaut mieux des amorces dont on connait la séquence et qui ont toutes la meme séquence, sinon notre calcul des delta Ct doit en être impacté, surtout qu'une fois qu'on a la bande en PCR classique il suffit de l'extraire et de l'envoyer à séquencer afin d'avoir la séquence exacte et de designer des primers pour la qPCR, (en plus avec du dégénéré on augmentelerisque de non spécifique) m'enfin bon, peut etre que Flying qui est bien plus calé que moi sur le sujet a déja vu ca, et que ca se fait tout de même.  [...] Oui je sais a quoi correspond le code dégénéré, (enfin... pas par coeur ^^) mais c'est vrai qu'en biologie classique c'est plutot risqué, mais je n'avais pas vu que tu faisais de l'environnemental, effectivement si tu cherche non pas la sequence d'un individus mais de tout un ensemble, la souplesse qui est souvent négative dans l'utilisation des primers dégénérés deviens ici un avantage.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage d'un gène

Sur le lien ci contre on peut voir qu'il faut des amorces connues pour trouver la séquence d'un gène inconnu. http.//www.snv.jussieu.fr/vie/dossie...e/sequence.htm.  [...] Or, si on veut trouver la séquence d'un gène se trouvant dans un génome non séquencé, comment peut on connaître la séquence des amorces utiles.  [...]

Utilité de la PCR en médecine ?

Si on veut savoir si cet individu est porteur d'un virus du sang, on va utiliser des amorces spécifiques d'une séquence du virus en question, et la PCR amplifiera cette séquence et cette séquence seulement, au détriment de tout le reste de l'ADN, qui était beaucoup plus abondant au départ (puisque le génome humain est beaucoup plus long que celui du virus).  [...] Alors non, tu n'es pas obligé de connaître la séquence de la mutation que tu recherches, car tu peux choisir des amorces qui encadrent le locus de la mutation. Tu amplifies, tu séquences et tu regardes ensuite si la séquence est anormale, et si oui quelle est la nature de la mutation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire.  [...] Amplifie un fragment plus grand contenant cette séquence (si possible avec des amorces publiées), isole ton grand produit de PCR et fait une PCR nichées avec tes amorces d'intérêt dessus.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Oui, je connais les principes de bases de la PCR. Donc, si moi je veux muter le deuxième site EcoRI dans la GFP pour BamHI, car les 2 sites EcoRI sont au deux l'extrimitées du gène.Est-ce que mes deux amorces seront la séquence de EcoRI et de BamHI C'est amorces ne sont-elle pas trop courtes.  [...] oui c'est un peu court. Mais pour ce genre de technique tu dois utiliser des amorces contenant la séquence que tu veux modifier, mais aussi une séquence commune avec ta matrice d'ADN. Comme ca l'amorce s'hybride partiellement avec ton ADN, et le reste contient ta mutation.  [...]

PCR et RT-PCR

Ah la RT PCR serait en fait une Reverse Transcription combinée à une PCR classique... Effectivement dans ce cas, une Taq Polymerase est indispensable et plusieurs cycles sont nécessaires aussi, peut etre une erreur quand j'ai pris mon cours alors.  [...] 3°) Une PCR classique nécessitera au moins 2 amorces (toujours par couples d'amorces), alors que la RT-PCR nécessite 1 amorce pour la transcription inverse, puis les amorces de la PCR effectuée sur l'ADNc.  [...]