• Forum - Amorces, Résultat, Bonne qualité

les problèmes du séquençage

s'il vous plait, je me demande si quelqu'un pourrait m'aider.j'ai fait le séquençage d'un clone contenant de l'ADN ayant la taille de 1100pb avec les amorces T7 et SP6 mais le résultat a montré une région de très bonne qualité sur les 250 premiers nucléotides alors que le reste est contaminé et on observe un bourrage de pics.  [...] Si la séquence est de mauvaise qualité dès le début, c'est probablement un problème d'ADN mal purifié, dans ce cas il suffit de repurifier et de reséquencer.  [...]

problème

jai fais plusieurs pcr à partir d'ADN obtenus de sang et les migrations me donnent toujours le meme résultat. pas de bande ou pas les bandes controles.  [...] les amorces ont été vérifiées, la qualité des ADN sont bonnes.  [...]

qPCR

Non des changements sont plutot de l'ordre de 70, 200, 500... mais si tu es toute seule comme tu le dis, es tu sur d'avoir les bons calculs peut etre tout simplement que personne ne t'as dit comment interpreter les résultats, que tu y as été a l'instinct, et que pour le coup c'est un peu compliqué si personne ne t'as expliqué comment faire, avant.  [...] nous avons vérifié la qualité des amorces par PCR classique puis sur gel d'agarose la taille correspond et pas d'autre bandes, aussi les melting curve ne montrent pas de présence de dimères, mes amorces étaient bonne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rt-pcr

Il s'agit d'ARN murins. ET oui, en effet, j'avais l'impression qu'ils été plus dégradés après traitement DNAse... je test donc la RNAse out avant de faire la DNAse demain matin. j'espère que le problème vient de là. je vous remercie pour vos conseils et vous tiens au courant des résultats.  [...] ça peut venir de tes amorces si tu n'as pas d'amplification avec d'autres échantillons de bonne qualité, elles ne sont peut-être pas spécifiques de ton 28S.  [...]

[Biologie Moléculaire] Température d'hybridation et MacVector

J'ai désigné deux amorces avec le logiciel MacVector pour faire une réaction PCR. La première amorce sens est de 27 bases et la deuxième antisens est de 21 bases. Lorsque j'ai fait le test des amorces par MacVector, il m'a dit que c'est bon pour les deux amorces et que la température de fusion Tm est de 62,1 pour les deux, et donc je peux conclure que la bonne température d'hybridation est 57,1.  [...] Mais, lorsque j'ai essayé de calculer la température d'hybridation par la fameuse formule 4(G+C) + 2(A+T) j'ai trouvé des températures d'hybridation de 69 pour l'amorce sens et de 61 pour l'amorce antisens. Je demande qui est le plus crédible. MacVector ou la formule classique.  [...]

[Biologie Moléculaire] RT-PCR semi-quantitative

Or, je n'ai eu de résultat qu'avec l'emploi d'une seule amorce, est ce que vous aurez une explication par hasard (sur le gel, je ne vois qu'un nuage de bandes du genre smear, pour l'échantillon avec 2 amorces).  [...] Pour moi semi quantitative suggère que l'on quantifie par rapport à une référence dont on ne connait pas la quantité exact. On donne donc le résultat en fold d'induction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quantité d'ARN pour PCRq

Ce qui est important dans ce cas, c'est la qualité des amorces, qui ne doivent pas faire de dimère de primers en présence de trop faible quantité de matrice.  [...] Ca le fait très très très largement, pas d'inquiètude, l'ARN que j'extrais n'est même pas dosable au nanodrop vu la mince quantité mais en faisant une RT avec des random hexameres pour améliorer le rendement, les ADNc fonctionnent très bien en PCRq.   [...]

[Biologie Moléculaire] Préparation de plasmide, chloramphenicol

3. Et puis autre question, j'ai egalement lu que l'origine de replication colE1 pourrait necessiter un cofacteur bacterien tres instable. Cultiver des bacteries avec ce plasmides en presence de chloramphenicol ne devrait donc pas permettre d'augmenter le nombre de copie par cellules, puisque si la synthese de proteine est inhibee, le facteur en question n'est pas renouvele, donc le plasmide n'est pas replique.   [...] Dans ton cas, je dirais déja que la réplication à besoin d'amorces d'ARN, et 2 plasmides ayant la meme ARN, incompatibilité.. l'un des deux empêche la duplication de l'autre d'où ton résultat.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème génotypage souris mutées

Je ne comprends vraiment pas ce qui se passe, c'est arrivé d'un coup alors que je n'avais absolument rein changé à mon protocole, je me suis dis que ça pouvait venir des souris en elles-même (mutation au niveau de l'amorce) mais ça n'explique pas le fait que j'obtiens deux résultats différents pour un même échantillon.  [...] J'ai pensé aussi qu'une des amorces pouvait avoir un problème (dégradée), donc j'ai recommandé les trois et j'ai le même résultat.  [...]

[Biologie Moléculaire] signal southern blot

Il y a quelques semaines j'ai coupé ma membrane en deux, j'ai hybridé la premiere partie avec un ancien tampon+sonde avec lequel j'avais obtenu de bon résultat.. et la deuxieme moitié avec le tampon et les sondes que j'utilise ces derniers moi.  [...] Cette sonde la je sais qu'elle fonctionne. Si je n'ai pas de bons resultats avec celle qu'ils auront marqué, c'est que ca vient de mon tampon... mais quoi dans le tampon aprés il a aussi ete refait plusieurs foi.  [...]