• Forum - Amorces, Quantité, ADN

sujet de TP Master microbiologie à réaliser : protocole à vérifier

Je suis étudiant en première année de Master 1 de microbiologie et j'ai un sujet de TP à réaliser. Je souhaiterais savoir si mon protocole vous convient.   [...] 2) Trouver des amorces spécifiques pour la PCR*.*(obtenir une quantité suffisante d'ADN ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr quantitative eficacité de la pcr

Pour améliorer l'efficacité, il faut jouer sur la pureté et la quantité de tes ADN (car on amplifie des ADNc, pas les ARN en quantitatif), les temps et température des différentes étapes, la concentration en MgCl2 et en amorces.  [...] Si tu utilises la méthode du delta Ct. si les efficacités des PCR ne sont pas identiques (ou au moins relativement proches), les pentes des droites (que tu génères en quantification absolue) ne seront pas parallèles, et tu vas introduire un biais dans tes calculs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification infructueuse

après pour les quantité d'ADN il me semble que ca depend un peu de la pol utilisé, par exemple avec phusion pol ca sature plus vite et il faut mettre un peu moins si je me souviens bien, pour ca que je trouve domage qu'ils ne précisent pas dans leur protocole la quantité optimale, mais sinon ducoup je suis sur du 80 ng dans 25 microlitre de V réactionnel en ce moment.  [...] J'ai entendu dire que le plus souvent quand il y a probleme d'amplification (du a la quantité d'ADN, ce qui est juste un hypothese ici) c'était plus souvent du a une surcharge qu'a une sous charge, s'l y a trop de materiel les amorces n'arrivent plus a s'hybrider, de plus dans le protocol ils pronostiquent 1-20 microlitres, (soit 0.  [...]

[Biologie Moléculaire] Courbes PCR en temps réel

Alors petit rappel. le principe de la PCR quantitative est qu'on est capable de suivre l'évolution de la quantité d'amplicon formée au fil des cycles. Pour cela, on a une matrice, une paire d'amorces ciblant la région que l'on veut amplifier, une enzyme, des nucléotides, et un colorant fluorescent de l'ADN.  [...] Cette PCR est dite quantitative, puisque vu qu'on est capables de savoir a tout moment combien on a synthétisé d'ADN dans le tube, on peut déterminer la quantité initiale de matrice. Cette quantité initiale est déterminée a partir du nombre de cycle nécessaire a ce que l'intensité de fluorescence atteigne un certain seuil.  [...]

[biologie moléculaire] PCR à partir d'ADN génomique

merci pour l'aide.. En fait vu que je suis assez limitée en matériel (ADN extrait d'échantillons de tumeurs humaines) j'étais parti avec 5-10ng lors de mes premiers essais mais sans résultat. Je me disais donc que c'était peut-etre parce que ma quantité d'ADN de départ était insuffisante car visiblement quand il s'agit d'ADN génomique il faut un petit peu plus forcer la dose et j'avais l'intention de réessayer avec 100ng donc piwi tu me confortes dans mon idée.  [...] si tu es limité par la quantité d'ADN, tu peux aussi augmenter la quantité d'amorces et augmenter le nombre de cycles (n= 35 à 40).  [...]

[Génétique] désignaion d'amorces pour une qpcr

SVP j'aurais besoin de désigner des amorces pour réaliser une PCR quantitative dans le but de quantifier le nombre de copies d'une famille d'élements transposables.  [...] Des amorces dégénérées pour une qPCR Non. Sinon l'efficacité d'amplification dépendra majoritairement de la probabilité d'hybridation de tes amorces et non plus de la quantité d'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] RT-qrt-PCR : courbe de fusion et autres contrôles

Qu'est-ce que cela changerait qu'il y en ait eu. une plus faible probabilité de fixation des amorces sur l'ADN à amplifier, donc une diminution de la vitesse d'amplification, donc une mauvaise estimation de la quantité d'ADN initiale.  [...] Le principe, c'est que la vitesse d'amplification du produit (en phase expo) varie dans le même sens que la quantité d'ADNc présent dans l'échantillon. en quoi cela m'indique quel est le problème des dimères de primers et le rôle des différentes dilutions.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

Déjà, il faut comprendre ce qu'on observe. le paramètre mesuré est un signal dont l'intensité dépend de la quantité d'intercalant intercalé dans l'ADN double brin. Ainsi, la différence de signal entre le début et la fin du run correspond à tout ce qui a été amplifié pendant le run.  [...] Enfin, courbe étalon. Elle permet de corréler la valeur du Ct que détecte la machine avec la quantité réelle d'ADN présente dans le tube au début du run. En théorie et comme vous le savez, la quantité d'ADN dans une PCR double à chaque cycle. En théorie oui mais ce n'est pas toujours vrai, et cela dépend de nombreux paramètres (qualité des amorces, quantité initiale, mix, paramètres de cycle, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

La PCR compétitive est basée sur la co-amplification de la matrice d'ADN cible et d'une quantités données d'un ADN standard interne (compétiteur ) portant les mêmes sites de fixation d'amorces.  [...] Alors que les systèmes de PCR en temps réel reposent sur la détection et la quantification d'un émetteur fluorescent pendant le processus d'amplification, et l'augmentation du signal d'émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons produites durant la réaction.  [...]

Housekeeping gene (gene de ménage)

Ce que j'ai envie de faire c'est de d'amplifier un gène de ménage (spécifique à l'Homme) dans un volume d'échantillon de sang donné puis amplifier le même gène dans le même volume d'échantillon de selle, puis faire une normalisation par dilution des quantités d'ADN. Qu'en pensez vous.  [...] À votre place j'etalonnerai avec une gamme obtenue avec des quantités décroissantes d'ADN extrait d'une quantité de cellules connue (pour avoir une quantification en nombre de cellules).  [...]