• Forum - Amorces, Extrémités, Séquence

[Biologie Moléculaire] Comment fabriquer une amorce PCR

Alors voilà, une question qui me titille depuis quelques temps. On me dit en cours que la PCR est un outil formidable car on peut amplifier des séquences choisies en fabriquant des amorces spécifiques. Mais comment fait-on pour obtenir la séquence de bases qu'on veut dans l'amorce.  [...] Par exemple, si vous voulez amplifier la région 500 à 1000 d'un gène, alors vous prenez une amorce s'hybridant du nucléotide 500 au nucléotide 520 (car les amorces que l'on utilise font le plus souvent 20 bases) en orientation sens (même séquence que la séquence codante du gène), et vous prenez une amorce s'hybridant du nucléotide 1000 au nucléotide 980 en orientation antisens (séquence complémentaire à la séquence codante du gène).  [...]

[Génétique] amorce et amplifiat

Bonsoir à tous svp svp je me demande s il y a quelqu'un pour me répondre à cette question. j'ai désigné une paire d'amorces mais ce dernier m'a donné un amplifiât qui, après clonage et séquençage a donné des extrémités qui ne correspondent ni aux séquences des amorces ni au début de la séquence attendue bien que le reste de la séquence soit intact.  [...] Comment peut-on expliquer ça c très urgennnnnnt.merciiiiiiiiiiiiiiiii d'avance.   [...]

[Biotechnologie] Principe de la PCR

montrer la meilleure complémentarité possible avec les deux extrémités de la séquence d'intérêt que l'on souhaite amplifier. L'une des amorces.  [...] Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de cycles dépend de la taille de la séquence d'intérêt ainsi que de la taille et de la complémentarité des amorces. Il convient de réduire les durées au minimum non seulement pour un gain de temps mais aussi pour prévenir le risque d'amplification non spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Méthode de diagnostic MLPA

Après hybridation parfaite du couple de sondes à la cible et ligature par l'ADN ligase, on réalise une PCR pour quantifier le nb de cibles présentes initialement en utilisant un seul couple d' amorces complémentaires aux séquences universelles notées X et Y.  [...] Ce que je ne comprends pas c'est comment on va pouvoir amplifier une séquence = la sonde, avec 2 amorces qui vont se lier aux 2 extrémités de cette même séquence Il ne faut pas respecter le sens 5'-3' (et donc, une amorce doit être complémentaire à X par exemple, et l'autre doit avoir la même séquence que Y).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Il faut que tu amplifies ta séquence par PCR en choisissant bien tes amorces. Il faut qu'elles soient complémentaires aux extrémités de ta séquences avec en plus une courte séquences qui ne correspondent pas à ton gène mais qui contiennent une séquence de restriction (on ajoute généralement quelques bases supplémentaires qui ne correspondent à rien et qui vont permettre à l'enzyme de bien se poser sur tes fragment lors de la digestion.  [...] Je précise que j'ai mis aussi des N dans. Promoteur-EcoR1-NNNNN-HindIII-TATAA mais cela n'a aucun rapport avec les N de tes amorces (NNNN-EcoR1-début de ta séquence et.  [...]

Insertion d'un promoteur sur un vecteur plasmidique

Sur ton insert, tu fais une PCR en utilisant 2 amorces hybridant aux extrémités de ton DNA. Pour l'amorce hybridant en 5', tu ajoutes en 5' de celle-ci la séquence de ton promoteur viral (je suppose que tu utilises un promoteur viral d'eucaryote, CMV par exemple), et le tour est joué.  [...] A désolé j'avais pas vu que tu demandait aussi comment l'isoler. Bein les séquences de ce types de promoteur sont archi connues donc quand tu commandes tes amorces, tu peux leur demander qu'ils te rajoutent ta séquence promotrice en amont de ton amorce 5' et le tour est joué.  [...]

[Biologie Moléculaire] transcriptase inverse

De plus ce que je ne comprends pas c'est que l'ARN ne contient que les séquences condantes puisque les introns sont excisés Donc comment l'ADNc qui contient que des séquences codantes peut s'hybrider avec un ADN contenant des séquences non codantes.  [...] Peut-être que vous avez confondu 'hybridation avec alignement, ou alors je ne connais pas cette technique. Si vous faites allusion au RNA-seq, une fois que l'on a obtenu le premier ADNc, il est fragmenté, des adaptateurs pour amorces de PCR et de séquençage sont ligués aux extrémités, puis il est séquencé et aligné sur le génome de référence.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR et Taq : répétition de nucléotide

Dans quel but fais-tu les produits de PCR Comment sont faites tes amorces pour le séquençage Quand je fais les miennes, je prévois à ce qu'elles donnent des séquences qui se recouvrent sur les extrémités. Et ça marche bien.  [...] Tu séquences en sens et en anti-sens Comment lis tu tes séquences D'après une séquence rendue par le programme de séquençage ou directement sur les pics avec un programme type bioedit Je te demande parce que parfois les programmes des séquenceurs ne parviennent pas à lire une séquence sur les pics parce qu'ils sont trop faibles, un peu étalés, qu'il y a un bruit de fond, mais en les regardant toi même tu y arrives et tu complètes tes trous.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Voilà, je n'ai pas compris la correction d'un TD à propos de la PCR. Par le fait que l'on utilise des amorces oligonucléotidiques de synthèse, il est possible d'ajouter des séquences dans la région 5' de chaque amorce. Par exemple, un site de restriction aux 2 extrémités du fragment d'ADN synthétisé permettrons ultérieurement d'assembler le produit PCR dans un plasmide.  [...] Je ne comprend pas vraiment...une sonde est complémentaire et antiparallèle de la séquence à étudier donc comment rajouter une séquence à l'extrémité 5' Celle-ci ne s'hybride pas Et puis une enzyme de restriction ne coupe que sur un ADN double brin donc je ne vois vraiment pas comment tout cel s'organise.  [...]

[Biotechnologie] Que veut dire ... ?

Seulement j'ai un peu de mal à comprendre une chose, comment des amorces peuvent digérer le produit de la PCR Puisqu'on intègre les séquences de AgeI et NcoI (et pas les enzymes elles-mêmes).  [...] en rajoutant certains nucléotides a tes amorces (qui representerons les extrémités de tout ce que tu auras amplifié) tu auras donc ajouté des petites séquences de part et d'autre de ton gène,  [...]