• Forum - Amorces, Digestion, Restriction

[Biologie Moléculaire] Clonage

Si tu peux fais des doubles digestions avec des enzymes n'ayant pas d'extrémité compatible pour éviter que ton plasmide ne se re-ligue sur lui même (Si possible biensure).  [...] J'imagine que tu dessines tes amorces en incluant les sites de restriction. Rajoutes-tu des nucléotides supplémentaires sur ces primers (les sites de restriction aiment bien être entourés pour une bonne digestion).  [...]

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.   [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...] Ok.merci on a choisi la PCR avec des amorces car la digestion de restriction je ne l'ai pas vu en cour. Par contre l'autre soucis c'est de savoir ensuite si je choisi une PCR/RFLP ou PCR/RAPD car meme avec les avantages et inconvénients des 2 je n'arrive pas à choisir.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

dites moi svp comment peut on trouver le nombre de fragments d'ADN produits lors d'une double digestion du plasmide pCR-gai par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI et leurs tailles respectives.  [...] sachant que pCR-gai est un plasmide d'environ 5500 pb qui contient la séquence codante du gene GAI (1579 pb), et le nombre de sites de restriction de HindIII est 2 et EcoRI est 2 par molécule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Il faut que tu amplifies ta séquence par PCR en choisissant bien tes amorces. Il faut qu'elles soient complémentaires aux extrémités de ta séquences avec en plus une courte séquences qui ne correspondent pas à ton gène mais qui contiennent une séquence de restriction (on ajoute généralement quelques bases supplémentaires qui ne correspondent à rien et qui vont permettre à l'enzyme de bien se poser sur tes fragment lors de la digestion.  [...] Une fois ta PCR faite, tu digères tes fragments avec les 2 enzymes et pareils avec ton plasmide. Quand tu choisis tes sites il faut que tu vérifies l'ordre dans lequel les sites de restriction sont présents sur le plasmide. Dans notre cas, il faut que EcoR1 soit avant HindIII et le tout après le promoteur déjà présent sur le plasmide (sinon ton insertion se fera à l envers). Donc il faut que ton plasmide ait.  [...]

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

prends ton plasmide et effectue des digestions avec une enzyme de restriction particulière (eco R1 par exemple) ensuite fait ton gel et fait migrer ton produit de digestions.  [...] Maintenant la méthode. elle est basée sur la taille des fragments de restriction, c'est-à-dire sur la taille des morceaux d'ADN obtenus après digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] choix des amorces

en fait, je suis face à une séquence d'ADN, pour laquelle on me demande d'établir le profil des amorces que je peux utiliser sans pour autant me donner les enzymes de restriction qu'on peut utiliser.  [...] Il faut éviter surtout les séquences formant des structures secondaires (genre des tiges boucles). Enfin il faut faire attention a ce que les deux amorces choisies ne s'apparient pas entre elles, ni ailleurs dans le génome/plasmide (donc eviter les longues répétitions monotones de A, ou de C, ou de G, ou de T).  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

Je pense que deux paires de bases c'est peut-être insuffisant pour permettre la digestion. j'avais l'ahabitude de mettre 4 à 5 base en amont de mon site de restriction, donnant un design d'amorce de ce genre.  [...] Voilà. l'idéal, si tu peux te le permettre, c'est avoir des sites de restriction différents sur tes amorces sens et antisens, comme ça lorsque tu fais ta ligation, pas de fermeture du vecteur sans insert, et pas df'insert dans le mauvais sens. (Je pense que ton vecteur possède un polylinker.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

cohésifs, tu peux mettre un site de restriction différent et unique a chaque bout de ton produit de PCR (avec les amorces), ensuite du digères et tu fais la ligation... COmme ça c'est orienté.  [...] La methode que tu as decrite est la meilleure pour ce genre de truc. Utiliser des sites de restriction va compliquer la chose. Es tu sur d'avoir bien purifie tes premiers produits PCR histoire de ne pas ramener des amorces dans ton 2eme tours de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Pour ce qui est de l'insert... Je réalise une PCR avec primers modifiés, c'est à dire que j'ai ajouté le site de restriction à une extrémité du primer. Le produit de PCR a été cloné dans TOPO pour faciliter la digestion des extrémités (vérif par séquençage).  [...] En fait je digère avec XbaI (qui se liguera à SpeI en perdant le site de restriction donc) et avec SacII pour l'autre extrémité... Après digestion, extraction sur gel et purification, je procède à la ligation... et à mon avis le problème c'est ça.  [...]