• Forum - Amorces, Amplification, Cible, Modèle, Limite, Detection

[Biologie Moléculaire] Question sur le design de sondes Taqman pour la PCR en temps réel

Lors du design de sondes Taqman avec un quencher BHQ, on part du principe que le Tm de la sonde doit être de 7-10°C de plus que celui des amorces, afin de s'assurer la spécificité de l'hybridation de la sonde.  [...] Quel est le risque d'utiliser une sonde Taqman BHQ dont le Tm est le même que celui des amorces Peut-il y avoir de l'amplification non spécifique de la cible pour laquelle le modèle a été designé La limite de détection du modèle peut-elle être modifiée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calibrateur et runs de PCR quantitative temps réel

Mes conditions d'amplification (MgCl2, [] amorces et T°C annealing) sont différentes pour mon gène cible et mon gène de référence.  [...] Pour chaque gène à amplifier, j'ai un très grand nombre d'échantillons. 32, du coup il me faudra faire 2 runs indépendants pour passer l'ensemble de mes échantillons pour un gène.   [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) où bien quel est l'intérêt de la banque.  [...] L'interêt d'une banque de cDNA comme son nom l'indique c'est de représenter un capital de gènes connus ou inconnus. La fabrication peut se gfaire soit en utilisant comme amorces des hexamers aléatoires ou bien des polyT ce qui permet en théorie de recopier tous les ARN messager possédant une queue 3' polyA.  [...]

bandes non spécifiques

j'ai fait une PCR pour amplifier les microsatellites. mais sur le gel mon encadreur m'a dit qu'il ya des bandes noin spécifiques. s'il vous plait qu'est ce que ce la veut dire.   [...] c'est des produits de PCR qui ne sont pas issus de l'amplification de ta cible, par exemple si la température d'hybridation est trop basse par rapport au Tm des amorces.  [...]

[Biotechnologie] Amplification par PCR

Par ailleurs, Pourquoi voulez vous créer des amorces qui ne soient pas entièrement spécifiques du fragment d'ADN que vous souhaitez amplifier La probabilité de rencontrer une base est de 1/4, celle de rencontrer deux bases précises est de 1/4. 3 bases, 1/8 etc.  [...] .. Quelle est la probabilité de rencontrer 6 bases Est-ce fréquent dans un génome de 3.10 9 pb La longueur d'identité de vos amorces par rapport au fragment cible n'est elle pas un moyen d'augmenter la spécificité d'amplification.  [...]

Question sur le fonctionnement des amorces en PCR

Si tu fais l'inverse, tu n'auras pas d'amplification vu que tu va t'éloigner de ta région cible puisque l'élongation se fait toujours de 5' vers 3'. Imagine toi que les amorces sont posées à l'autre bout de chaque brin avec la flèche orientée vers l'extérieur.  [...] Le sens de l'amplification ne dépend pas des amorces mais de la DNA polymerase qui ne va que dans un sens. A partir de là, vous devriez pouvoir imaginer ce que cela vous donnerait de faire comme vous l'entendez.  [...]

[Biologie Moléculaire] Questions relatives à la PCR

Ainsi, je reformule. Lors d'une détection de la séquence Alu, qu'est-ce qui pourrait expliqué que j'obtienne une très faible quantité de produits PCR après amplification. La question ne se limite pas à cette expérience. Ce que je veux savoir c'est.  [...] Lors d'une détection de la séquence Alu, qu'est-ce qui pourrait expliqué que j'obtienne une très faible quantité de produits PCR après amplification.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

La PCR compétitive est basée sur la co-amplification de la matrice d'ADN cible et d'une quantités données d'un ADN standard interne (compétiteur ) portant les mêmes sites de fixation d'amorces.  [...] Alors que les systèmes de PCR en temps réel reposent sur la détection et la quantification d'un émetteur fluorescent pendant le processus d'amplification, et l'augmentation du signal d'émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons produites durant la réaction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Prochainement en stage dans un laboratoire de recherche, j'aimerais avoir quelques informations concernant la méthode LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification, afin de ne pas arriver trop largué.  [...] - 4 à 6 amorces pour amplifier plusieurs (6 à 8) séquences spécifiques de l'ADN cible, dont 2 forment une boucle pour améliorer l'amplification.  [...]

[Biologie Moléculaire] Concentration Primers

( Cette technique diffère de la technologie TaqMan, qui justement, utilisent des amorces marquées, et ainsi tu vas détecter le produit spécifique de ton amplification.  [...] Le seul point sur lequel tu dois faire attention avec le SybrGreen, c'est qu'à l'inverse du Taqman qui ne détecte que l'amplification de la séquence cible, tout ce qui est double brin est quantifié, y compris les dimers de primers et les produits aspécifiques.  [...]