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Etudier l'expression d'ARN non codants

Mais en ce qui concerne les ARN sans queue poly-A, par exemple les ARNm d'histone ou bien des longs ARN non codants comment faire au niveau de la RT-PCR Pas de sonde poly-T possible du coup.  [...] On utilise fréquemment des amorces hexameres aléatoires qui permettent donc de retrotranscrire tous les ARN.  [...]

[Génétique] PCR ou RT-PCR

La RT n'est pas forcément spécifique. par exemple, tu veux quantifier un ARN particulier dans un tissu. Pour ça, tu fais une RT avec les ARN extraits de ce tissu avec des amorces aléatoires, tu obtiens donc des ADNc correspondant à tous tes ARN. Ensuite tu peux amplifier par PCR une région spécifique en utilisant des amorces spécifiques.  [...] J'ai fait de la RT-PCR et j'ai toujours utilisé des amorces spécifiques pour la RT, pour une raison toute simple, mon milieu était complexe, si je pouvais supprimer une partie des ARN présents dans mon échantillon et avoir donc moins d'ADNc interférents par la suite, on s'en portait bien mieux.  [...]

[Biologie Cellulaire] Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

Les amorces aléatoires sont de courtes séquences oligonucléotidiques synthétisées de façon aléatoire et comprenant 6 (hexamères), ou 8 (octamères) nucléotides. Ces amorces vont, statistiquement, avoir une chance de se fixer sur l'ensemble des ARN présents dans la matrice.  [...] En revanche, les amorces aléatoires pouvant se fixer à différents niveaux de l'ARN, la rétrotranscription est généralement incomplète et on obtient peu d'ADNc pleine longueur. On utilise en général des hexamères. Les octamères favoriseraient l'efficacité de l'amorçage en cas de RT à température élevée.  [...]

[Génétique] Extraction, purification et analyse d'ARN (Nanodrop et bioanalyser)

Héhé, bonne question. En principe tu as autant d'ARNm que de cDNA, plus tous les ARN non rétrotranscrits (donc ARNt et r). Perso, lorsque je fais une RT avec des pDN6 (des amorces de 6 nucléotides aléatoires, donc potentiellement non sélectifs du type d'ARN) la quantité d'acides nucléiques double apres la RT.  [...] Cette fois, cela concerne la PCR (directement après avoir purifié et RT les ARNm). Durant la PCR, nous avions amplifié seulement des ADNc spécifiques (avec deux amorces, Amy2 et TBP).  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

L'interêt d'une banque de cDNA comme son nom l'indique c'est de représenter un capital de gènes connus ou inconnus. La fabrication peut se gfaire soit en utilisant comme amorces des hexamers aléatoires ou bien des polyT ce qui permet en théorie de recopier tous les ARN messager possédant une queue 3' polyA.  [...] Dans la pratique, pour séparer les ADNc simple brin des ADNc partiellement double brins, nous pouvons utiliser des amorces biotinylées pour créer le double brin partiel et séparer les doubles brins à l'aide de colonnes de streptavidine (voir Figure 5). Les doubles brins seront retenus dans la colonne et les simples brins récupérer.  [...]

Random priming

Pour les sondes de Southern blot, elles ne s'hybrident pas à une séquence inconnue mais belle et bien connue. On amplifie par PCR la sonde avec des amorces connues sur une matrice connue et on la purifie. Ensuite, avec des amorces aléatoires, on utilise cet amplicon comme matrice en présence de dNTPs marqués.  [...] Mais du coup, la question que je me pose c'est. quel est l'intérêt de cette technique pour fabriquer des sondes marquées par rapport à d'autres plus anciennes comme la nick-translation par exemple (cassures dans l'ADN double brin puis repolymérisation avec dNTP radio par une ADN pol I) Il me semble avoir lu quelque part que l'idée d'utiliser ces amorces aléatoires avait créé une mini-révolution car cela se révélait beaucoup plus pratique mais je ne vois pas bien pourquoi, puisque ça fait exactement la même chose.  [...]

[Biochimie] Comment choisir une amorce pcr ?

A priori je dirais ce qu'on appelle les amorces aléatoires.  [...] Euh je suis moyennement calée donc à vérifier mais oui il y a des sequences consensus et même énormément donc si tu ne la connais pas tu n'as pas l'amorce en rapport.  [...]

Amorces aléatoires PCR RAPD

Pour trouver des amorces spécifiques, je pense donc faire de la RAPD avec des amorces aléatoires mais je ne connai pas bien cette technique, quelqu'un peut il me l'exposer en détail étape par étape.  [...] Il est préférable de créer une nouvelle discussion pour poser ses questions.   [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage d'un gène

Sur le lien ci contre on peut voir qu'il faut des amorces connues pour trouver la séquence d'un gène inconnu. http.//www.snv.jussieu.fr/vie/dossie...e/sequence.htm.  [...] En fait ta réponse est un peu dans ta question ^^. On connaît la séquence des amorces car c'est le chercheur lui-même qui créer ses amorces qu'il va par la suite fixer à la séquence inconnue du gène.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique SELEX aidez moi!

Ainsi on a une collection d'oligo de régions aléatoires portées sur des oligonucléotides bordés de sites d'hybridation pour deux amorces.  [...] Armé de cela on va réaliser un PCR qui va nous permettre d'amplifier nos matrices. On a donc un grand nombre de matrices aléatoire.  [...]