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[Biochimie] Travaux pratiques de biochimie des systemes integrés urgents

En général juste pour la fluorescence tu transfecte la cellule avec un plasmide contenant la protéine d'interet suivie de la GFP (ou EGFP pour les eucaryotes je pense) Il s'agit d'une construction à faire à l'aide par exemple d'un plasmide EGFP dans lequel tu insères ta séquence d'interet (mais les manips sont longues, il faut compter un mois au moins).  [...] Le protocole de ceci comprend une première PCR pour produire ton gène d'interet à l'aide de primer possédant des extrémités suplémentaires contenant un site de restriction semblables à ceux présents sur ton plasmide EGFP.  [...]

[Biologie Moléculaire] Librairie de génes !!

Bonjour tout le monde, c'est quoi une librairie de génes elles peut être façonnées par des souches d' E.coli...merci bien.   [...] Pour moi c'est comme une banque de gènes. C'est à dire qu'on a trouvé à quoi le gène correspond et on le conserve dans une banque. Pour cela on introduit la séquence à l'aide d'un plasmide dans une bactérie souvent E.coli (parce qu'on l'aime bien.). Et puis quand on en a besoin, on décongèle et la bactérie se multiplie et amplifie la séquence d'intérêt que l'on récupère et voilà.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fournisseur plasmide d'expression (avec ORF spécifique)

J'ai un plasmide gateway (sans promoteur) de chez Invitrogen et je suis déjà en train de faire sortir la séquence pour la mettre dans un pDEST, mais nous avons quelques problèmes.  [...] La question que l'on pose à l'aide de ce plasmide est urgente donc j'aimerai trouver le plus vite possible un plasmide d'expression AVEC PROMOTEUR et l'ORF d'intérêt. J'ai regardé chez Dharmacon, Invitrogen, Qiagen, Eurogentec et je n'ai rien trouvé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

Le vocabulaire que tu utilises n'est pas le bon. On ne parle pas d'incorporation mais de transformation (même si on comprend le sens). La bactérie est transformée par un plasmide. Plasmide intact. ça ne veut pas dire grand chose, là il faut parler de plasmide non recombiné.  [...] tu sélectionnes d'abord les transformants sur ampicilline, puis, à l'aide d'un tampon de velours, tu répliques les clones de la boîtes ampi sur une boîte contenant de la tétracycline. Ceux qui poussent ont le plasmide sans le gène d'intérêt. Ceux qui ne poussent pas ont le plasmide, mais leur gène TetR est inactivé et donc le gène est potentiellement inséré dedans.  [...]

[Biologie végétale] Compréhension d'un article sur les OGMs

Dans le cas du plasmide Ti d'agrobactérium, de manière similaire on y ajoute notre gène d'intérêt qui va remplacer l'ADN-T, ce plasmide est réintégré au sein d'agrobactérium et ce dernier infecte ensuite une plante et transfert l'ADN-T, on obtient donc comme ça un OGM.  [...] 2) En 2.4 ils parlent de deux méthodes. Freeze-thaw et leaf disc. Le freeze thaw permet simplement de briser les cellules d' Agrobacterium tumefaciens pour que les vecteurs contenant le gène d'intérêt (qui remplaceraient donc le plasmide Ti ) entrent dans la cellule.  [...]

[Biotechnologie] Plasmide recombinant

2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène phénotypique - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.  [...] 7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence front gauche et front droit dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.  [...]

Ogm

Le gène d'intérêt ne peut être dans le plasmide de part avance. Ce gène d'intérêt doit déjà être une construction composée d'un promoteur venant d'un organisme, du gène qui porte le nom d'intérêt venant d'un autre organisme,et d'un terminateur venant lui aussi d'un autre organisme.  [...] En fait les plasmides existe en plusieurs exemplaires dans la bactérie (selon la taille du plasmide et sont utilité ça peut aller de quelques exemplaires a plusieurs dizaines) mais c est surtout par la multiplication des bactéries que le nombre de plasmides est augmenté ensuite on fait éclater les cultures bactériennes et on récupère les plasmides d intérêt.  [...]

[Biochimie] Manipulation de l'ADN: plasmide

je suis actuellement en première année de licence en biologie et nous avons étudié les plasmides mais je n'ai pas tout compris notamment sur la carte de réstrction. Quelle est son principe et qu'est ce qu'un site de réstrction, une origine de réplication, un promoteur et un terminateur.  [...] L'intérêt est de couper ET notre morceau d'ADN d'intérêt ET le plasmide avec le MÊME enzyme de restriction. Ainsi lorsqu'on les mets en présence l'un de l'autre, ils auront tendance à s'attacher et nous permettre de refermer le plasmide nouvellement constitué.  [...]

[Biologie Moléculaire] Passer par le double hybride ?

Le double hybride me permettrai de récupérer la sous-unité gamma à l'aide de la béta (vu qu'il y a une forte intéraction entres-eux). Il me suffirait () alors de récupérer les clones positifs (normalement eux seuls auront poussés sur le milieu minimum), de vérifier par PCR (pour éliminer les faux-positifs) puis d'envoyer le plasmide au séquençage, non.  [...] Pour le double hybride c'est pas si simple. Il faut que ta protéine d'intérêt s'exprime bien dans les cellules (levure ou bactérie, il faut parfois tester plusieurs conditions de culture). Il faut ensuite voir dans quelle mesure elle n'autoactive pas le système.  [...]

[Microbiologie] Exercice carte de restriction

Un plasmide a été ouvert avec BamHI (en un seul site) pour y insérer un gène d'intérêt. Le plasmide a été digéré de différentes manières avec B. BamHI, E.EcoRI et H.Hind III. (le gel est en pièce jointe).  [...] J'ai commencé avec BamHI puisqu'il détermine le gène d'intérêt, sur le gel on voit deux bandes donc deux fragments, un de 3000pb (gène d'intérêt) et l'autre de 9000pb (le vecteur). L'échelle n'est pas très précise donc j'ai fixé la taille du plasmide + insert à 12000pb.  [...]