• Forum - ADN, Vecteur, Enzymes, Restriction

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

Je ne suis pas certaine d'avoir bien compris le recours aux enzymes de restriction dans la construction d'un vecteur.  [...] On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...]

[Biologie Moléculaire] ligation

Par exemple, lorsque tu fais ta digestion, il est conseillé de faire des témoins négatifs (sans enzymes de restrictions), des témoins positifs (lors d'une double digestion, tu vas faire deux témoins de simple digestion), puis tu vas faire migrer le tout (ton produit de digestion, tes trois témoins) sur des gels d'agarose.  [...] - Soit on clive le vecteur avec deux enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts collants incompatibles. L'insert est clivé avec les même enzymes. Cette méthode a l'avantage d'empêcher la recircularisation du vecteur et favoriser une insertion orientée de l'insert dans le vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

J'aimerai globalement connaitre la démarche pour récupérer une séquence promotrice d'une banque BAC pour ensuite le cloner dans un vecteur rapporteur et étudier ce promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]

Enzymes de restriction

Pourquoi les enzymes de restriction découpent-elles n'importe quel ADN, sauf celui de la bactérie dont elle provient... qui est protégé.  [...] une petite question sur les enzymes de restriction. elles protègent les bactéries des phages donc elles coupent l'ADN simple et double brin mais sont elles capables de couper l'ARN.  [...]

[Biochimie] Clonage vecteur navette sur la levure

Dans un exercice on me demande d'énumérer les étapes qu'il me reste à accomplir (après avoir amplifier ma séquence Insert) afin d'exprimer la protéine voulue dans une levure. Cependant, je bloque sur une étape.   [...] -Digérer l'Insert et le vecteur par les enzymes de restriction.. ok.  [...]

Carte de restriction ( génétique)

Un ADN est digéré par trois enzymes (EcoRI, PstI, SmaI) afin de réaliser une carte de restriction. Après électrophorèse sur gel d'agarose, les résultats obtenus sont les suivants*(taille des fragments observés).  [...] Déterminer la carte de restriction de cet ADN en expliquant clairement et précisément vos choix. Chacun des trois enzymes utilisés reconnaît une séquence spécifique et distincte des deux autres.  [...]

[Biochimie] Petite interrogation sur les enzymes de restrictions

Excuse moi si je n'est pas utilisé le bon terme, j'ai écris ce message un peu rapidement, c'est vrai que c'est LA PCR et, vous avez raison, il n'y a pas d'enzyme de restriction mais ce sont les enzymes polymérase dont je parlais (ou TAQ polymérase). Voilà après cette correction pouvez vous répondre à ma question précedemment posé.  [...] Vous etes sur qu'il ne s'agit pas d'enzymes de restriction Ca collerait plus a l'interrogation initiale de Valentino6 puisque en effet, la police peut étudier l'ADN en analysant les polymorphisme de restriction (RFLP) qui justement peut faire invervenir un grand nombre d'enzymes différentes.  [...]

amplification de l'ADN

moi, je veux savoir si, au moment de l'ajout de l'amorce, c'est possible de lier au bout de la sequence une suite de nucleotides qui auraient la meme fonction qu'une amorce...cela reviendrait a coller une suite de nucleotides a un brin d'ADN deja coupe. Etant donne que, in vivo, il existe des enzymes qui ont les proprietes de couper et coller des genes ou suites de nucleotides, je me demande si je peux les utiliser pour enchainer des bouts d'ADN.  [...] Et oui, il est également possible de faire des couper/coller de bouts d'ADN avec des enzymes de restriction. C'est comme ça qu'on fait des vecteurs pour transfecter des gènes dans des cellules. Mais c'est pas non plus de la PCR et on se sert pas d'amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.  [...] Et oui, toujours séquencer à chaque étape, ça évite de se retrouver en fin de travail avec un vecteur dont l'insert porterait une mutation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Dans tes colonies vecteur+insert il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase. Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle.  [...] Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...]