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comment cloner une enzyme extraite d'une cellule animale?

merci pour vos réponses qui m'aident beaucoup. Aussi quelques recherches m'ont permis de voir que je pouvais aussi explorer la voie de la protéomique puisque je ne connais pas la séquence protéique. pouvez-vous m'aider concernant cette méthode.  [...] Voilà, mais dans ces deux cas, obtenir la séquence complète peut être difficile (il faut quand même assez de produit et c'est assez cher)... d'où mon insistance pour obtenir un fragment n-ter et rétrotranscrire, puis amplifier via un polyT et ton amorce spécifique N-ter, cloner dans un plasmide et hop là (en espérant que l'ARN messager soit bien rétrotranscrit, et que la PCR se passent bien...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...] Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème. il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).  [...]

transgenese

C'est aussi le vecteur qui, par sa propre construction (exemple, présence de promoteurs forts), pourra assurer ou contrôler l'expression des gènes clonés (vecteurs d'expression).  [...] De l'ADN plasmidique est injecté dans le tissus cible (par exemple le muscle de la patte d'une souris) puis on applique deux plaques d'acier contre la patte qui servent ainsi d'électrode, on envoie ensuite des impulsions électriques répétées, en essayant de trouver les fréquences et intensité correspondant au meilleur transfert.  [...]

Séquençage

J'ai juste une petite question, dans les projet de séquencage de génome de grande taille l'utilisation de vecteur est nécessaire. Je sais que la séquence d'ADN que l'on veut étudier doit être scindée afin de placer les inserts obtenus dans des vecteurs. Ces vecteurs seront ensuite clonés à l'aide d'organisme hôtes.  [...] DOnc puisque la séquence génomique est inconnue, selon toi il est impossible d' effectuer une PCR...car le problème réside dans les amorces nécessaire à cette étape...mais suite à l'amplification de nos insert dans les vecteurs...il faudra bien que l'on dessine des amorces pour que la méthode de Sanger puisse fonctionnée.  [...]

[Génétique] Notion d'insert et de vecteur

J'ai eu une seance de TD de genetique avec des exercice concernant ces notions mais je n'ai pas eu de cours auparavant, et mon professeur est flamand et sans etre mechant, malgres mes questions impossible d'obtenir une reponse que je puisse comprendre.   [...] En générant les même extrémités au niveau de l'insert, celui ci pourra s'apparier avec les extrémités du vecteur car si tu remarques ce sont des séquences dites palindromiques. la moitié 5' de la séquence est complémentaire de la moitié 3'. Une fois collé, on reconstitue un fragment d'ADN circulaire avec l'insert inséré.  [...]

[Biologie Moléculaire] Equivalent de Vector NTI

Vu que je possède avec mon équipe une base assez conséquente de vecteur, j'aimerai trouver d'une part un logiciel équivalent à vertor NTI mais gratuit et d'autre part que celui-ci soit compatible avec le format d'enregistrement de vector NTI c'est à dire les fichier.  [...] Je fais surtout du design de vecteur, donc il me faut un logiciel capable d'annoter les séquences facilement, capable de comparer des séquences, de passer de l'ADN à la séquence protéique biensur.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre.  [...] Pourquoi as tu changé de plasmide si tu en avais un qui marchait très bien as tu séquencé l'intégralité de la séquence clonée dans le nouveau plasmide pour etre sur que tout est ok.  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

Dans cette fenêtre de construction, il faut ouvrir la séquence du vecteur, choisir les sites de début (simple clic) et de fin (double clic). Faire de même avec l'insert. Blunter si nécessaire et cliquer sur Ligate. Notez que si l'insert est, par exemple, EcoRI (début)/BamHI (fin) alors le vecteur doit être ouvert par BamHI (début) / EcoRI (fin).  [...] En fait je me demandais si avec ce logiciel on pouvait directement mettre le vecteur circulaire (séquence), spécifier avec quelles enzymes on veut couper, et qu'il nous donne la séquence du vecteur linéaire déjà découpée. Ou sinon pas grave je le ferai à la main.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquences répétées inversées

Pas exactement. Une séquence répétée inversée est contenue dans un vecteur par exemple afin d'inactiver un gène d'un génome. Cette séquence est constitué du gène en question (5'-3') et de la séquence de ce gène mais inversées (3'-5').  [...] Si on veux invalider un gène ATTCC par exemple contenu dans un gènome, on transforme le microorganisme par un vecteur contenant la séquence ATTCCCCTTA (soit la séquence du gène à invalider et la séquence du gène mais inverser).  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

pGL2 est un vecteur un peu plus compliqué. On trouve une f1 ori + polyA coding sequence qui a du vous perturber. Cette construction sert à produire de l'ADN simple brin, si besoin. La polyA cs juste derrière sert à insérer un terminateur histoire d'éviter qu'un promoteur cryptique ne vienne produire des transcrits non désirés (réducteur de bruit de fond).  [...] En suite on trouve les choses pertinentes pour votre travail. Deux cassettes de clonages qui entourent le gène de la luciférase + polyA cs. L'idée de ce vecteur est de cloner des promoteurs ou des séquences régulatrices pour tester dans quel mesure des facteurs cis et trans activateurs peuvent activer la transcription de la luciférase.  [...]