• Forum - ADN, Rapporteur, Promoteur, Facteur

technique du double hybride

En utilisant une séquence d'ADN codant pour un gène rapporteur sous le controle d'un promoteur activé par le facteur de transcription, on peut fixer la cible sur l'ADN via le domaine de liaison de l'ADN du facteur de transcription. Comme le système ne possède pas le domaine de transactivation, il n'y a pas d'activation de l'expression du gène.  [...] Si il y a interaction, il y aura reconstitution du facteur de transcription actif du fait de la proximité des domaines de liaison à l'ADN et du domaine de transactivation. Du coup le gène rapporteur sera activé.  [...]

[Biochimie] étude de promoteur

Une manip' envisageable est de faire un test rapporteur dans une lignée cellulaire. Vous clonez votre promoteur ou des morceaux de votre promoteur en amont de la séquence codante d'un gène rapporteur (CAT, Luc). Vous cotransfectez avec un plasmide codant pour votre facteur de transcription.  [...] En général, l'approche d'invalidation de l'élément de réponse d'un facteur de transcription par mutagenèse dirigée se fait après la troncation régulière du promoteur (énoncé brièvement par Piwi. morceaux de promoteurs en amont d'un gène rapporteur). Celle-ci permet de confirmer la position de l'élément de réponse sur le promoteur est pourquoi pas découvrir un nouvel élément de réponse zappé par le programme bioinformatique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment pRb peut-elle augmenter l'activité d'un promoteur ?

De plus, grâce à un système rapporteur Luciférase, on mesure l'activité d'un promoteur Y qui ne contient pas de module E2F et DP. Cette activité est mesurée seul, en présence de facteur C/EBP5, et en présence de C/EBP5+Rb. Les résultats montrent que l'activité Luciférase est nettement supérieure en présence de Rb.  [...] La première expérience consiste à digérer l'ADN de façon aléatoire. la DNase va donc couper partout, sauf là où est fixé le ou les facteurs. On a donc des fragment de toutes tailles. Ensuite un trou est visualisé par électrophorèse, qui correspond à l'endroit où se fixe le facteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dégradation de la cycline D1

Pour le double hybride, on fusionne l'ADNc de la cycline D avec le domaine de transactivation de GAL4, et en parallèle on fusionne les ADNc des ubiquitine ligase connues avec le domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Les deux vecteurs sont transfectés dans des levures avec un gène rapporteur sous contrôle d'un promoteur contenant l'élément de réponse de GAL4.  [...] Si la cycline D interagit avec une ubiquitine ligase, cette interaction rapproche le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 avec son domaine de transactivation et cela active l'expression du gène rapporteur qu'on peut visualiser (levures bleues si le gène rapporteur code la beta-galactosidase).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

J'aimerai globalement connaitre la démarche pour récupérer une séquence promotrice d'une banque BAC pour ensuite le cloner dans un vecteur rapporteur et étudier ce promoteur.  [...] Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...]

[Biologie Cellulaire] Fusion transcriptionnelle et traductionnelle

Maintenant si tu veux non plus localiser une protéine d'intérêt mais quantifier l'activité d'un promoteur donné entre plusieurs conditions, tu peux construire quelque chose comme [promoteur d'un gène d'intérêt]-[5'UTR]-ATG-séquence codante d'un gène rapporteur-STOP-[3'UTR et terminateur de transcription].  [...] Plus le promoteur sera actif dans la cellule plus le gène rapporteur sera transcrit plus il y aura la protéine codée par le gène rapporteur. Pour une quantification on n'utilise pas la GFP mais quelque chose comme la bêta glucuronidase par exemple, j'ai oublié la réaction mais plus tu auras de bêta glucuronidase plus tu auras un précipité bleu que tu pourras doser, renseignant sur l'activité initiale du promoteur de ton gène d'intérêt. c'est la fusion transcriptionnelle.  [...]

T1 et T2 generation GUS

Est-ce qu'il faut s'attendre a des difference entre des expression GUS gene rapporteur (promoteur rapporteur) suivant si on utilise des plantes de generation T1 ou T2. Qu'est ce qu'il vaut mieux utiliser.  [...]

[Génétique] Mutagenèse

Si j'ai à identifier les bases importantes d'un promoteur qui est déjà dans un vecteur-sonde. (il y a 1000 bases).  [...] Il faut avancé petit à petit. Un bon moyen est de commencé par caractérisé des régions importantes au niveau de ton promoteur. Pour cela tu peux réalisé des délétions de régions de plus en plus importante de ton promoteur et regarder l'impact sur la fonctionnement de ce promoteur en le couplant à un gène rapporteur par exemple.  [...]

[Génétique] Enhancer trap

Mais je ne vois pas l'utilité d'insérer un facteur de transcription dans une souche.. et un gène rapporteur dans une autre.. à part pour voir que quand on les croise il y aura expression du gène rapporteur.. je ne vois pas la finalité le but et donc Y a t il une suite.  [...] Admettons que tu veuilles insérer deux gènes, A et B. Sur le plasmide a, tu y mettras un facteur de transcription (exogène) + gène A. Sur un plasmide b, tu y mettras l'enhancer (spécifique du TF) + gène rapporteur + gène B. Ensuite, tu sauras que les colonies qui expriment le gène rapporteur ont forcément les deux plasmides intégrés.  [...]

[Biotechnologie] Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

J'aurai mis un gène de sélection (un gène de résistance aux antibiotique ou un gène du métabolisme pr la levure) et un gène rapporteur, un promoteur, MCS (un site de clonage multiple). Tu peux mettre le + 1 avec la flèche juste après le promoteur.  [...] Et sinon, on peut parfois trouver un intron dans certains vecteurs d'expression (entre le promoteur et le gène), je crois que ça augmente la capacité d'expression. Mais je ne crois pas que ce soit nécessaire.  [...]