• Forum - ADN, Fragment, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq

Pour économiser du temps et de l'argent, je pense pas faire les étapes que vs avez cité (en plus le plasmide il faut commander car non dispo chez moi).  [...] J'ai simplement le nom de la souche, comment je peux commander le plasmide linéarise contenant la séquence cible avec une concentration connue.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif.  [...] Comme tu l'as dit. plasmide + ligase = voir les plasmides mal digérés, mal déphosphorylés. Si la ligase est mauvaise, un faible nombre de bactéries transformées sera peu représentatif de l'efficacité réelle de la digestion et surtout de la déphosphorylation. On peut alors partir sur une fausse piste.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur

comment voit on quand les Extremités cohesives ne sont pas compatibles entre le vecteur ouvert et un fragmentPouvez vous me donner un exemple car j ai du mal a comprendre ca svp.  [...] Pour maintenir la linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5'. Le plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au fragment d'ADN à insérer en présence d'une ligase.  [...]

[Biotechnologie] Clonage???

Comment feriez-vous pour cloner un fragment d'ADN linéarisé par ECOR1(G/AATTC) dans un plasmide ouvert par PVU2(GAG/CTC).  [...] L'ajout de polylinker pour PVU2 à l'ADN avec le T4 (pour avoir des extrémité franches).  [...]

[Microbiologie] clonage

je dois cloner un fragment d'ADN dans un plasmide pbluescript, j'ai digéré le vecteur par ECO RI je dois effectué une déphosphorylation afin d'éviter la recircularisation de plasmide, comment je peux m'assurer que la déphosphorylation a été faite avec succès après l'avoir traité par la phosphatase alcaline.  [...]

plasmide-clonage

En les faisant pousser sur milieu complet + ampiciline, seul les bactéries avec le gène de résistance contenu dans le plasmide survivront.  [...] on met ensuite le plasmide dans des bactéries qui n'ont pas justement de géne re resistance a l'antibiotique, ce qui permet de localiser celle qui ont reçu le plasmide.  [...]

[Génétique] Notion d'insert et de vecteur

Si quelqu'un pouvait m'eclaircir s'il vous plait ^^ notemment avec un petit schema representant les paires de base si possile ^^' du genre. AATCGATT.   [...] Sinon brève explication. Un vecteur est souvent un fragment d'ADN circulaire, tel que le plasmide. L'insert est un fragment linéaire que tu veux insérer dans le vecteur. Pour cela il te faut ouvrir le vecteur. On prend une enzyme de restriction car elle coupe en laissant de part et d'autre de la coupure des bouts collants car une partie de ces bouts est simple brin et peut donc s'apparier avec un autre fragment simple brin de séquence complémentaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

c'est a peut pres ca, sauf que si tu fais une etape de PCR c'est le produit de PCR que tu digeres directement, pas le plasmide. Tu ne peux pas cloner un gène par restriction directement a partir de l'ADN genomique.  [...] Il est très possible de cloner un fragment d'ADN génomique amplifié par PCR dans un plasmide extrait mais non amplifié, mais il est préférable de déterminer la concentration approximative disponible de ces 2 olécules avant de les utiliser.  [...]

[Microbiologie] mutagenèse dirigée par pcr

j'ai effectué une mutagenèse dirigée par pcr pour modifier trois codons de la séquence de la souche Mycoplasma meleagridis je trouve toujours des difficultés lorsque je mute plus qu'un codon en plus au moment de l'assemblage je trouve toujours des bandes non spécifiques pourtant j'ai modifier les paramètres physiques (température) ainsi que les paramètres chimiques.  [...] merci pour la réponse mais je tiens à vous informer que je vais effectuer une mutagenèse dirigée par pcr à partir d'un fragment d'adn qui n'a pas été préalablement inséré dans un plasmide tel qu'il est mentionné dans le kit pouvez vous me donner plus d'éclaircissement sur ce sujet.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

pour les canals 2 3 et 4 j'ai compris que puisqu'il n'y a qu'un site de restriction, le plasmide est ouvert à un endroit et le fragment est toujours de même taille. Mais je ne comprends pas ce qu'il en est du canal 1, le plasmide est pas digéré et on a plein de fragments de tailles différentes.  [...] Un plasmide n'est pas une cellule. C'est un fragment petit d'ADN circulaire doté d'une capacité autoréplicative. Faire cette erreur c'est un peu comme confondre un chromosome avec une cellule.  [...]