• Forum - ADN, Buffer, Enzyme, Volume

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ADN génomique

peut-être que je dit une bêtise mais pourquoi ne pas essayer avec d'autres enzyme de restriction ou alors, regarde si tu peut utiliser encore le même enzyme mais avec un Buffer différent.  [...] C'est assez étrange. J'aurais plutôt tendance à penser à un mauvais ratio ADN/buffer/enzyme/volume final. Il ne change pas entre les petits volumes et les grands.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Tous les buffers sont concentrés 10X. Il ne faut jamais mettre plus de 1/10 du volume final en enzyme. En général je digère dans 50µl avec 5µl de buffer et 5µl d'enzyme. Vérifie bien qu'il ne faille pas ajouter de BSA. Certaines enzymes le nécessitent. Vérifie aussi la température d'activité maximal.  [...] La ligation se fait dans de petits volumes, en principe 10µl. Dans le milieu de ligation il vous faut mettre le buffer de la ligase (en principe concentré 10X). De l'enzyme. Sa concentration peut varier mais en général en mettre 1µl est suffisant. Enfin il est très important de ne pas oublier de mettre de l'ATP.  [...]

[Biologie Moléculaire] Buffer et enzyme differents....

Voila je voulais tout simplement savoir si y avait vraiment une importance d'utiliser le buffer et l'enzyme de la meme compagnie C'est a peu pres la meme enzyme donc le buffer devrait presque etre identique.  [...] Je viens d'utiliser un buffer Klenow ''roche'' et l'enzyme ''fermentas'' donc j'aimerai bien savoir au cas ou ma manip' foire, si ca pourrait venir de la.  [...]

[Microbiologie] digestion de plasmide

H buffer est le buffer pour l'enzyme promega. Pour la même enzyme chez NEB ce sera n'importe quel tampon (NEB1 à 4). Chez fermentas, c'est le orange buffer. Chez Roche se sera le buffer A... Il va sans dire que tous ces buffers sont différents. La bonne pratique recommande d'utiliser le buffer correspondant à l'enzyme du fournisseur.  [...] Pas faux piwi. Maintenant comme tu l'as dit, le buffer est spécifique de firme alors je sais pas si c'est une meilleure idée de le faire soi-même. En pratique, l'enzyme est normalement la même, donc le tampon devrait l'être aussi. Je crois qu'il est possible de trouver un tableau de comparaison entre les buffers des différentes firmes (sur biolabs je crois).  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Alors, pour synthétiser le brin complémentaire pendant la PCR, il faut des bases azotées (dNTP, les mono-nucléotides), des amorces pour ne répliquer qu'une partie de l'ADN (qui doit correspondre à la partie que tu veux explorer), et un milieu favorable pour que les enzymes de réplication fonctionnent bien (c'est le buffer, qui contient souvent du MgCL2).  [...] L'enzyme va copier l'ADN entre ces deux amorces. Elle a besoin de bases/nucléotides. dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Elle ajoute donc bout à bout chaque base depuis l'amorce de départ jusqu'à l'amorce de fin. D'où l'utilisation de la Taq polymérase, des amorces et des dNTP.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR RFLP conventionelle

Sachant que notre volume final sera 50 ul donc qu'il est le volume initial de la MgCl2 à prendre si la concentration final est 50 mM ET c INITIALE = la concentration fournie par le tube de stock EST 50 mM.  [...] mais pour le labo dans lequel je suis en stage contient un buffer (tampon) sans MgCl2 alors comment je pourrais faire pour calculer le volume de MgCl2 à pipter sachant que la concentration de MgCl2 founie par le stock = 50 mM.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Ba si y en a pas assez tu peux avoir une amplification mais tu le vera pas sur le gel. En plus si c'est de l'ADN génomique, ta concentration est élevé mais ton nombre de copie beaucoup moindre. Et inversement, petit fragment avec concentration identique, sa fait beaucoup de copies... Tu est à combien en MgCl2.  [...] J'utilise un buffer fait maison qui contient 20mM de Mgcl2. Mais j'en rajoute pas pour ma PCR. Et j'utilise 2.5ul de buffer pour un volume final de 25ul pour la PCR.  [...]

Rôle des composants du Edward Buffer (tampon d'extraction d'ADN)

Rôle des composants du Edward Buffer (tampon d'extraction d'ADN).  [...] - NaCl 0,5M. responsable de la plasmolyse des cellules qui libèrent leur contenu qui n'est plus retenu par la paroi pectocellulosique (en sachant qu'on a déjà broyé mécaniquement les fragments) ou pour que le SDS soit soluble dans l'alcool.   [...]

Protein en conditions réductrices

J'ai une enzyme que je souhaite protéger de l'oxydation. Je cherche un buffer pour solubiliser mon enzyme en conditions réductrices, et qui aurait la propriété de ne pas réduire les ponts disulfure. J'ai pensé au DTT, au ²-ME mais aussi au TCEP et au Glutathion.  [...] Avez-vous des indications sur le choix du composé à utiliser et sur sa concentration Vos conseils sont les bienvenus. Merci.   [...]

[Biologie Cellulaire] Comment dissoudre la Collagenase

enzyme stock solution is prepared by dissolving 0.05 - 0.1 mg/ml collagenase in 50 mM TES buffer, pH 7.4, containing 0.36 mM calcium chloride.  [...] Ce qui m'intrigue, c'est l'utilisation du Serum de veau foetal pour diluer la solution mère de collagenase, je croyais que le SVF inhibait les enzymes. qu'en pensez vous.  [...]